Microdissection من الأنسجة الجنينية العين اسماك الزرد
Summary
توضح هذه المقالة نهج لشبكية العين microdissect الزرد مع وبدون صباغ الشبكية ظهارة المرفقة ، 1-3 أجنة postfertilization يوما.
Abstract
الزرد هو نموذج حيواني شعبية للبحث حول التنمية بسبب العين السريعة لها<em> السابقين الرحم</em> التنمية والخصوبة جيدة. قبل 3 أيام الإخصاب آخر (DPF) ، سوف تظهر اليرقات أول استجابة بصرية. وقد تم تحديد العديد من الجينات لمراقبة تطور العين سليمة ، ولكن ما زلنا بعيدين عن فهم كامل للبنية الوراثية الكامنة. كامل التعبير الجيني التنميط الجينوم هو أداة مفيدة لتوضيح الشبكة التنظيمية الجينية للتنمية العين. ومع ذلك ، فإن صغر حجم العين الجنينية في الزرد يجعلها صعبة للحصول على أنسجة العين سليمة ونقية للتحليل التعبير. على سبيل المثال ، وطول الأمامي الخلفي للعين بين 2 و 3 ايام فقط ما يقرب من 200-300 ميكرون ، في حين أن قطر العدسة أقل ميكرومتر 100. أيضا ، والظهارة الصبغية الشبكية (RPE) الكامنة وراء شبكية العين هو مجرد الظهارة طبقة واحدة. في حين يمكن الحصول على ملامح التعبير الجيني من الجنين كله ، فهي لا تمثل بدقة التعبير عن هذه الأنسجة. بالتالي لا بد من الحصول على نسيج النقي عن التنميط الجيني التعبير ناجحا للتنمية العين. لمعالجة هذه المسألة ، وقد طورنا نهجا لmicrodissect الشبكية سليمة وشبكية العين مع RPE المرفق من DPF 1-3 ، والتي تغطي المراحل الرئيسية التشكل العين. يمكن أن تتم جميع الإجراءات مع ملقط غرامة ولوازم المختبرات العامة في إطار stereomicroscopes القياسية. لتشريح الشبكية ، تتم إزالة RPE طبقة واحدة ، وخلع من قبل التنظيف العمل والتقيد تفضيلية من مخلفات RPE على سطح لوحة الثقافة لتشريح. لRPE المرفقة تشريح الشبكية ، تتم إزالة RPE انضمام إلى لوحة تشريح قبل تشريح بحيث يمكن للRPE تماما مع الحفاظ على شبكية العين. ويمكن لعمل دقيق لرفع هذا النسيج منفصلة بكفاءة المشيمية الظنية والصلبة. ويمكن إزالة العدسة في كلتا الحالتين بواسطة إبرة التنغستن محفورا كيميائيا. باختصار ، يمكن الحصول على نهجنا أنسجة العين سليمة ، واستخدمت بنجاح لدراسة ملامح الأنسجة محددة التعبير الشبكية الزرد<sup> 1 ، 2</sup> والشبكية الصباغ الظهارة<sup> 3</sup>.
Protocol
Discussion
ويمكن للأنسجة العين Microdissection الزرد الحصول على شبكية العين سليمة وفعالة شبكية العين RPE المرفقة. هذا يساعد كثيرا الدراسات المتعلقة التعبير نسيج العين محددة (شبكية العين أو أي RPE). في الواقع ، لقد نجحنا في استغلال هذه الإجراءات للحصول على الحمض النووي الريبي ملامح التعبي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويؤيد هذا العمل من قبل صندوق بدء التشغيل من قسم العلوم البيولوجية في جامعة بوردو.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cordless pestle motor | VWR | 47747-370 | ||
| DC power supply | Lascar | PSU130 | Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization. | |
| Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free) | VWR | 47747-366 | These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis. | |
| Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox | World Precision Instruments | 500341 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox | Fine Science Tools | 11252-00 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm | BD Biosciences | 351007 | These plates are used as dissection plates. | |
| Olympus SZX16 Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed. | |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary | |
| Thermo plate | Tokai Hit | MATS-U55SZX2B | This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success. | |
| Trizol, 100 mL | Invitrogen | 15596-026 | ||
| tungsten wire, 0.015 inch diameter | World Precision Instruments | TGW1510 | ||
| Wooden Applicator | Puritan | 807 | This is used for holding the chemically-etched tungsten needle. |
Referências
- Leung, Y. F., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina. Zebrafish. 2, 269-283 (2005).
- Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).
- Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish : a practical approach. , (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).
