Microdissezione dei tessuti oculari Zebrafish embrionali

Summary

Questo articolo descrive un approccio alla microdissect retine zebrafish con e senza epitelio pigmentato retinico collegato, da una a tre embrioni postfertilization giorni.

Abstract

Zebrafish è un modello animale popolare per la ricerca sullo sviluppo degli occhi a causa della sua rapida<em> Ex utero</em> Lo sviluppo e la fecondità bene. Entro 3 giorni dopo la fecondazione (DPF), le larve mostrerà la prima risposta visiva. Molti geni sono stati identificati per controllare un corretto sviluppo degli occhi, ma siamo lontani da una comprensione completa dell'architettura di base genetica. Intero gene profiling genoma espressione è uno strumento utile per chiarire genetica rete normativo per lo sviluppo dell'occhio. Tuttavia, le ridotte dimensioni dell'occhio embrionale in zebrafish lo rende difficile da ottenere tessuti oculari integro e puro per analisi di espressione. Per esempio, la lunghezza antero-posteriore dell'occhio tra il giorno 2 e 3 è di circa 200-300 micron, mentre il diametro della lente è circa 100 micron. Inoltre, l'epitelio pigmentato retinico (RPE) sottostante la retina è solo un singolo strato epitelio. Mentre profili di espressione genica possono essere ottenute da un embrione intero, essi non rappresentano accuratamente l'espressione di questi tessuti. Pertanto tessuto puro deve essere ottenuto per un profilo di espressione genica di successo dello sviluppo dell'occhio. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un approccio alla microdissect retina intatta e retina con RPE attaccato da dpf 1-3, che coprono le fasi principali della morfogenesi dell'occhio. Tutte le procedure possono essere fatte con una pinza sottile e materiale di laboratorio, in generale stereomicroscopi standard. Per la dissezione della retina, il monostrato RPE viene rimosso e staccata dalla spazzolatura azione e l'adesione preferenziale dei resti RPE alla superficie della piastra di coltura per la dissezione. Per RPE-attached dissezione della retina, l'adesione di RPE alla piastra dissezione viene rimosso prima che la dissezione in modo che la RPE può essere completamente conservato con la retina. Una attenta azione di sollevamento di questo tessuto può efficacemente separare la coroide presuntivo e nella sclera. L'obiettivo può essere rimosso in entrambi i casi da un ago di tungsteno inciso chimicamente. In breve, il nostro approccio può ottenere tessuti oculari intatto ed è stato utilizzato con successo per lo studio dei tessuti specifici profili di espressione di retina zebrafish^{1, 2} E dell'epitelio pigmentato retinico³.

Protocol

Parte 1: Preparativi prima di microdissezione Soluzioni E3 media 4 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 e 0,33 mM MgSO 4). Soluzione di Ringer 1, 5 (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH7.2), filtro sterilizzato. 5N NaOH. Attacco chimico di aghi di tungsteno Fissare un piccolo becher contenente NaOH 5N su una piastra di Petri di argilla. F…

Discussion

Microdissezione dei tessuti dell'occhio zebrafish può effettivamente ottenere retine intatte e RPE-attached retine. Questo aiuta notevolmente studi di espressione relativi a un tessuto oculare specifico (retina o alla RPE). In effetti, abbiamo utilizzato con successo queste procedure per ottenere profili di espressione di RNA della retina tutto RPE ¹ e ^3. L'utilità di questi profili è fortemente sostenuta dal nostro recente identificazione di percorsi e di famiglie di geni che sono pertu…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Cordless pestle motor		VWR	47747-370
DC power supply		Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)		VWR	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox		World Precision Instruments	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox		Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm		BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope		Olympus	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone		Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate		Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL		Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter		World Precision Instruments	TGW1510
Wooden Applicator		Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.