Summary
Kvantifiering av DNA dubbel-strängbrott på grundval av γH2AX foci har blivit ett ovärderligt verktyg, särskilt i strålningsbiologi, för utvärdering av vävnaden strålkänslighet och effekter av strålning ändra föreningar. Här har vi demonstrera användningen av ett immunofluorescens test för kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover.
Abstract
DNA dubbel-strängbrott (DSBs) är särskilt dödlig och genotoxiska skador, som kan uppstå antingen genom endogena (fysiologiska eller patologiska) processer eller av yttre faktorer, framför allt joniserande strålning och radiomimetiska föreningar. Fosforylering av H2A histon varianten, H2AX på serin-139 rester, i starkt konservativa C-terminal SQEY motiv, bildar γH2AX, är ett tidigt svar på DNA dubbel-strängbrott
Protocol
Vävnader
- Lungvävnad, inbäddade i formar i optimal kapning temperatur (oktober) förening 4583, var uppställd (5 mikrometer) med hjälp av en CM Leica 1950 kryostat och monteras på poly-L-lysin diabilder.
Den frysta togs från Dr Simon Royce på Murdochs Barnens Forskningsinstitut. Lungvävnad erhölls från obehandlade BALB / möss C och från en musmodell för kronisk allergisk luftvägssjukdom som visar många av de patologiska drag av mänskliga astma 6. Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges i djuretik kommitté Murdochs Barnens Research Institute, som följer den australiska uppförandekod för vård och användning av försöksdjur för vetenskapliga ändamål.
- Avsnitten var tillåtna att lufttorka i rumstemperatur i 1 timme.
Immunofluorescens färgning
- Avsnitten har fastställts med 2% (w / v) paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 20 minuter.
- Avsnitten var jämvikt med två tvättar i PBS i 15 minuter vardera.
- Sektioner behandlades med 70% etanol (kyld till -20 ° C) i 20 minuter följt av tre tvättar i PBS i 10 minuter vardera.
Vid denna punkt diabilder kan förvaras i slutna behållare vid 4 ° C i upp till två veckor.
- Sektioner sköljdes tre gånger med PBS i 10 minuter vardera och sedan blockerade med 100μL nytillagade i PBS som innehåller 8% BSA i PBS med 0,5% Tween-20 och 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) för 1 timme i rumstemperatur .
Alla inkubationer utfördes i en fuktig färgning tråg. - Sektioner spolades med PBS-TT i 5 minuter och en hydrofob omkrets präglades runt vävnad med ett Pap penna.
- Överflödig buffert blev tipsad och 100μl av primär kanin polyklonala anti-γH2AX antikropp (utspätt 1:500 i 1% BSA i PBS, Millipore), lades till varje avsnitt för ett 2 timmars inkubation vid rumstemperatur.
Inkubation med primära antikroppen kan utföras över natten vid 4 ° C.
För ytterligare bevis, att γH2AX fokus representerar DSBs kan en primär antikropp erkänna en DSB reparation protein också användas. Till exempel är co-lokalisering av γH2AX och fosfor ATM en vanligt förekommande kombination. - Sektioner spolades två gånger i PBS-TT i 5 minuter vardera och inkuberas med 100μl av sekundär antikropp (Alexa Fluor 488 get-anti-kanin IgG utspädd 1:500 i 1% BSA, Invitrogen) under 1 timme vid rumstemperatur i mörker . (Efter utspädning antikroppar hölls i mörker under hela förfarandet).
- Sektioner sköljdes tre gånger med PBS-TT i 5 minuter vardera och inkuberas med 0.5mg/mL RNAse A för 30 minuter vid 37 ° C.
- Kärn motfärgning och montering utfördes med Vectashield medium som innehåller propidiumjodid.
- Bilderna var förseglade med nagellack och lagras över natten vid 4 ° C i mörker före analys.
Mikroskopi / Analys
- En Zeiss LSM510 Meta konfokalmikroskop var van att få bilder med standarden GFP (för γH2AX - Alexa Fluor 488 get-anti-kanin IgG) och PI (543 nm) lasrar.
Bilder förvärvades i ett Z-serie mönster med en steglängd på 0,5 mm. Under analysen var individuell plan deconvoluted och staplas för att producera en maximal projicerad bild för att minimera överlappning av foci.
Den metod för att skapa en maximal projicerade bilden innan en partikel räkna bör endast användas i de fall då en tunn avsnitt (t.ex. 5μm) används och där bakgrundsfärgning är obetydlig. När tjockare sektioner med en betydande bakgrund måste analyseras, bör en mer komplex analys som 3D-objekt Counter som beskrivits av Bolte och Cordelieres (2006) användas 7.
- Metamorfa (Molecular Devices, USA) användes för att skapa samman (röd och grön) bilder till kvantifiera antalet foci.
Även metamorfa kan användas för att kvantifiera härdar nummer, typiskt när man använder vävnadssnitt härdar räknas manuellt (med ögat) för större noggrannhet.
Specifika celltyper av intresse kan väljas för kvantifiering, till epitelceller exempel lungceller. Detta kan göras baserad på histologi och med hänvisning till hematoxylin och eosin färgade serie avsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För denna demonstration använde vi vävnad musen lungor från obehandlade BALB / möss C och från en musmodell för kronisk allergisk luftvägssjukdom. Vi kvantifieras skillnader i antalet foci per cell med något högre medelvärden som observerats i den skadade lungan jämfört med obehandlade avsnitt. Specifikt anges kvantifiering 6,5 foci per / cell och 9,4 fokus per / cell (manuell räkning av 20 celler per avsnitt), i den obehandlade vävnaden och kronisk allergisk luftvägssjukdom vävnad, respektive. Däremot skulle användandet av en DSB-inducerande medel, till exempel naftalen, som är känt för att framkalla DSBs i musen lung-modellen, ge högre foci nummer. Det är detta protokoll mest lämpade för undersökning av effekterna av joniserande strålning i vävnader, mer slående resultat, i termer av γH2AX foci siffror och upplösning erhålls när joniserande strålning används. Det är väl känt att efter exponering för röntgenstrålar, γH2AX fokus formen snabbt och fokus siffror uppgå till högst mellan 30-60 minuter 2. Därför, 1 timme tidpunkter (efter bestrålning) är idealiska för att utvärdera första DSB bildning och längre tid (vanligtvis upp till 48 timmar) kan användas för att övervaka DNA-reparation.
Totalt sett är kvantifiering av γH2AX i vävnader användbara för övervakning DSB bildning och reparation. Bortsett från dess nytta i samband med joniserande strålning, kan metoden tillämpas på utvärdering av effekten av DSB-inducerande substanser i olika vävnader, till exempel vanligt förekommande cytostatika, antracykliner såsom doxorubicin är kända för att orsaka DSBs, och eventuellt att övervaka olika sjukdomar som kännetecknas av reaktiva syreradikaler-medierad DSBs. Viktigare är att detta protokoll lämpar sig för olika mus vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Stödet från Australian Institute of Nuclear Science and Engineering är erkänd. TCK var mottagare av AINSE utmärkelser. Epigenomiska Medicin Lab stöds av det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien (566.559). LM stöds av Melbourne Research (University of Melbourne) och biomedicinsk avbildning CRC stipendier kompletterande. Stödet från Monash Micro Imaging (DRS Stephen Cody och ISKA Carmichael) var ovärderlig för detta arbete. MMT är tacksam för sakkunnig hjälp och råd från Dr Olga Sedelnikova från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
