ΓH2AX foci के ऊतकों के नमूनों में quantitation
Summary
डीएनए γH2AX foci के आधार पर डबल भूग्रस्त टूटता quantitation एक अमूल्य उपकरण बन गया है, ऊतक radiosensitivity और विकिरण संशोधित यौगिकों के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए विकिरण जीव विज्ञान में, विशेष रूप से,. यहाँ हम γH2AX foci के ऊतकों के नमूनों में quantitation के लिए एक immunofluorescence परख का उपयोग प्रदर्शित करता है.
Abstract
डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता है (DSBs) विशेष रूप से घातक और genotoxic घावों, कि या तो अंतर्जात (शारीरिक या रोग) प्रक्रियाओं के द्वारा या exogenous कारकों, विशेष रूप से विकिरण और radiomimetic यौगिकों द्वारा पैदा कर सकते हैं कर रहे हैं. H2A histone संस्करण, H2AX सेरीन-139 अवशेषों पर, की phosphorylation उच्च संरक्षित सी टर्मिनल SQEY आकृति में γH2AX बनाने, कतरा डीएनए डबल टूटता एक प्रारंभिक प्रतिक्रिया है<sup> 1</sup>. इस phosphorylation घटना 3-kinase phosphatidyl – inosito (PI3K) प्रोटीन के परिवार, गतिभंग telangiectasia उत्परिवर्तित (एटीएम), डीएनए प्रोटीन kinase उत्प्रेरक सबयूनिट और एटीएम और RAD3 संबंधित द्वारा मध्यस्थता है (एटीआर)<sup2></sup>. कुल मिलाकर, DSB असतत परमाणु γH2AX foci के गठन में शामिल परिणाम है जो आसानी से हो सकता है और पता लगाया जा सकता immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा quantitated<sup2></sup>. यह देखते हुए अद्वितीय विशिष्टता और इस मार्कर की संवेदनशीलता, γH2AX foci के विश्लेषण जैव चिकित्सा अनुसंधान में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नेतृत्व किया गया है, विकिरण जीव विज्ञान और परमाणु चिकित्सा में विशेष रूप से,. γH2AX foci के quantitation सबसे व्यापक रूप से किया गया है विकिरण प्रेरित DSBs के संदर्भ में सेल संस्कृति प्रणालियों में जांच की. सेलुलर radiosensitivity के अलावा, immunofluorescence आधारित assays की प्रभावकारिता विकिरण संशोधित यौगिकों का मूल्यांकन किया है प्रयोग किया गया है. इसके अलावा, γH2AX एक आणविक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है विभिन्न DSB उत्प्रेरण यौगिकों की प्रभावकारिता की जांच और हाल ही में उम्र बढ़ने और रोग की महत्वपूर्ण मार्कर के रूप में शुरुआत की जा रही है, विशेष रूप से कैंसर<sup> 3</sup>. इसके अलावा, immunofluorescence आधारित विधियों सूट पता लगाने और γH2AX foci के quantitation को अनुकूलित किया गया है<em> पूर्व vivo</em> और<em> Vivo में</em<sup4,5></sup>. यहाँ, हम का पता लगाने और माउस के ऊतकों में γH2AX foci के quantitation के लिए एक ठेठ immunofluorescence विधि प्रदर्शित करता है.
Protocol
Discussion
हम अनुपचारित Balb / ग चूहों से और जीर्ण एलर्जी वायुमार्ग रोग के एक माउस मॉडल से माउस फेफड़े के ऊतकों का इस्तेमाल इस प्रदर्शन के प्रयोजन के लिए. हम foci के संख्या में सेल के प्रति थोड़ा अधिक अनुपचारित वर्गों की…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
परमाणु विज्ञान और इंजीनियरिंग के ऑस्ट्रेलियाई संस्थान का समर्थन स्वीकार किया है. TCK AINSE पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था. Epigenomic चिकित्सा लैब राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (566,559) द्वारा समर्थित है. LM मेलबोर्न (मेलबोर्न विश्वविद्यालय) अनुसंधान और बायोमेडिकल इमेजिंग सीआरसी अनुपूरक छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है. मोनाश माइक्रो इमेजिंग के समर्थन (डीआरएस स्टीफन कोड़ी और Iśka Carmichael) इस काम के लिए अमूल्य था. एमएमटी विशेषज्ञ और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से डॉ. ओल्गा Sedelnikova से सहायता और सलाह के लिए आभारी है.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Referências
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
