조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation
Summary
γH2AX foci을 바탕으로 DNA 이중 가닥 나누기의 Quantitation는 조직 radiosensitivity 방사선 수정 화합물의 효과 평가를 위해, 특히 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 조직 샘플에서 γH2AX foci의 quantitation위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.
Abstract
DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)은 내생 (생리적 또는 병리) 프로세스 또는 외인성 요인, 특히 이온화 방사선 및 radiomimetic 화합물을 통해 발생할 수 특히 치명와 genotoxic 병변입니다. 세린 – 139 잔여물에서 H2A 히스톤 변형, H2AX,의 인산화는 높은 보존 C – 터미널 SQEY의 모티브에 γH2AX을 형성, DNA 이중 가닥의 휴식 시간에 초기 응답입니다<sup> 1</sup>. 이 인산화 이벤트는 phosphatidyl – inosito 3 키나제 (PI3K) 단백질의 가족 운동 실조증 telangiectasia 변이된 (ATM), DNA – 단백질 키나제 촉매 subunit와 ATM과 RAD3 관련하여 중재입니다 (ATR)<sup> 2</sup>. 전반적으로, 이산 핵 γH2AX foci의 형성에 DSB 유도 결과는 쉽게 감지하고 immunofluorescence 현미경에 의해 quantitated 수있는<sup> 2</sup>. 이 마커의 고유한 특이성과 감도, γH2AX foci 분석은 특히 방사선 생물학 및 핵 의학, 생명 의학 연구에 응용 프로그램의 다양한되었다 감안할 때. γH2AX foci의 quantitation는 가장 널리 이온화 방사선 유발 DSBs의 맥락에서 세포 배양 시스템에서 조사되었습니다. 외에도 세포 radiosensitivity에서 immunofluorescence 기반 assays도의 효능 방사선 – 수정 화합물을 평가하는 데 사용되었습니다. 특히 암, 또한, γH2AX 다양한 DSB – 유도 화합물의 효능을 검사하기위한 분자 마커로 사용되었으며, 최근에는 노화와 질병의 중요한 마커로 이동해되고있다<sup> 3</sup>. 또한, immunofluorescence 기반의 방법은 γH2AX foci 정장을 감지 및 quantitation 적응되었습니다<em> 예 생체내</em>과<em> 생체내에</em<sup> 4,5</sup>. 여기서는 마우스 조직에서 γH2AX foci의 감지 및 quantitation에 대한 전형적인 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.
Protocol
Discussion
우리가 치료 Balb / C 마우스에서와 만성 알레르기기도 질환의 마우스 모델에서 마우스 폐 조직을 사용하는이 예제의 목적을 위해. 우리는 치료 부분에 비해 손상된 폐에서 관찰 약간 높은 평균과 셀 당 foci의 숫자의 차이를 quantitated. 특히, quantitation는 각각의 치료 조직 및 만성 알레르기기도 질환의 조직에서 / 셀 당 6.5 foci 및 9.4 foci 당 / 셀 (항목 당 20의 세포 수동으로 계산) 지적했다. 그러나, 마?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. LM은 멜버른 연구 (멜버른 대학)와 바이오 메디컬 이미징 CRC의 보조 장학금으로 지원됩니다. 모나 마이크로 이미징의 지원 (DRS 스티븐 코디 Iśka 카마 이클)이 작품 소중한했다. MMT는 국립 보건원에서 박사 올가 Sedelnikova에서 전문가 지원 및 조언 감사합니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Referências
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
