La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus
Summary
La quantification de l'ADN double-brin de brise sur la base de γH2AX foyers est devenu un outil précieux, en particulier dans la radiobiologie, pour l'évaluation de la radiosensibilité des tissus et des effets des rayonnements composés de modification. Ici nous démontrons l'utilisation d'un test d'immunofluorescence pour la quantification des γH2AX foyers dans des échantillons de tissus.
Abstract
L'ADN des cassures double brin (CDB) sont des lésions particulièrement meurtrières et génotoxiques, qui peuvent survenir soit par des processus endogènes (physiologique ou pathologique) ou par des facteurs exogènes, en particulier le rayonnement ionisant et les composés radiomimétique. La phosphorylation de l'histone H2A variante, H2AX, à la sérine-139 résidus, dans le très conservé C-terminal motif SQEY, formant γH2AX, est une réponse précoce à l'ADN des cassures double brin<sup> 1</sup>. Cet événement de phosphorylation est médiée par la phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) famille de protéines, de l'ataxie télangiectasie muté (ATM), sous-unité kinase ADN-protéines catalytiques et ATM et RAD3 liés (ATR)<sup> 2</sup>. Globalement, les résultats d'induction ORD dans la formation de foyers discrets nucléaires γH2AX qui peuvent être facilement détectés et quantifiés par immunofluorescence<sup> 2</sup>. Compte tenu de la spécificité et une sensibilité uniques de ce marqueur, l'analyse des γH2AX foyers a conduit à une large gamme d'applications dans la recherche biomédicale, en particulier en radiobiologie et en médecine nucléaire. La quantification de γH2AX foyers a été plus largement étudié dans les systèmes de culture cellulaire dans le contexte de rayonnements ionisants induit CDB. En dehors de la radiosensibilité cellulaire, immunofluorescence tests basés ont également été utilisés pour évaluer l'efficacité des radiations modifier composés. En outre, γH2AX a été utilisé comme un marqueur moléculaire pour examiner l'efficacité des diverses ORD induisant composés et est annoncée comme étant récemment marqueur important du vieillissement et des maladies, en particulier le cancer<sup> 3</sup>. En outre, les méthodes basées sur l'immunofluorescence ont été adaptés à la détection de costume et la quantification des foyers γH2AX<em> Ex vivo</em> Et<em> In vivo</em<sup> 4,5</sup>. Ici, nous démontrons une méthode typique d'immunofluorescence pour la détection et la quantification des γH2AX foyers dans les tissus de la souris.
Protocol
Discussion
Aux fins de cette démonstration, nous avons utilisé les tissus pulmonaires de souris Balb traitées à partir / souris c et à partir d'un modèle murin de la maladie chronique des voies respiratoires allergiques. Nous quantifié les différences dans le nombre de foyers par cellule avec des moyennes légèrement plus élevée observée dans les poumons endommagés par rapport aux sections non traitées. Plus précisément, la quantification indiquée par 6,5 foyers / cellule et 9,4 foyers par / cellulaire (compta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le soutien de l'Institut australien des sciences et techniques nucléaires est reconnu. TCK a été récipiendaire du prix AINSE. Laboratoire de médecine épigénomique est soutenu par la National Health and Medical Research Council de l'Australie (566 559). LM est soutenue par la recherche de Melbourne (Université de Melbourne) et biomédicale bourses d'imagerie complémentaires CRC. Le soutien de Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody et Iska Carmichael) a été inestimable pour ce travail. MMT est reconnaissant pour l'assistance d'experts et de conseils du Dr Olga Sedelnikova du National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Referências
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
