Количественная оценка γH2AX Очаги в образцах тканей
Summary
Количественный анализ ДНК двунитевых разрывов на основе γH2AX очагов стал бесценным инструментом, особенно в области радиационной биологии, для оценки радиочувствительности тканей и воздействию радиации изменения соединений. Здесь мы демонстрируем использование иммунофлуоресценции для количественного определения γH2AX очагов в образцах тканей.
Abstract
ДНК двунитевых разрывов (ДР) особенно смертоносным и генотоксического повреждения, которые могут возникнуть либо эндогенного (физиологического или патологического) процессов или экзогенных факторов, в частности, ионизирующего излучения и радиомиметическое вещество соединений. Фосфорилирование H2A гистонов вариант, H2AX, на серин-139 остатка, в хорошо сохранились и С-концевой мотив SQEY, образуя γH2AX, является ранний ответ на ДНК двунитевых разрывов<sup> 1</sup>. Это событие фосфорилирования опосредуется фосфатидил-inosito 3-киназы (PI3K), семейство белков, атаксия телеангиэктазия мутировал (ATM), ДНК-протеинкиназа каталитической субъединицы и банкоматов и RAD3 связанных (ATR)<sup> 2</sup>. В целом, DSB индукции приводит к образованию дискретных ядерных γH2AX очаги, которые могут быть легко обнаружены и количественно с помощью иммунофлуоресценции микроскопии<sup> 2</sup>. Учитывая уникальную специфичность и чувствительность этого маркера, анализ γH2AX очагов привело к широкому кругу приложений в области биомедицинских исследований, особенно в радиационной биологии и ядерной медицины. Количественного определения γH2AX очагов была наиболее широко исследовалось в системах клеточных культур в условиях ионизирующего излучения, вызванная ДР. Помимо сотовых радиочувствительности, иммунофлюоресценции основан анализов были также использованы для оценки эффективности излучения модифицирующих соединений. Кроме того, γH2AX был использован в качестве молекулярного маркера для изучения эффективности различных DSB вызывающие соединений и недавно обставляется как важный маркер старения и болезней, особенно рака<sup> 3</sup>. Кроме того, иммунофлюоресценции методы, основанные были адаптированы для обнаружения костюм и количественного определения очагов γH2AX<em> Исключая виво</em> И<em> В естественных условиях</em<sup> 4,5</sup>. Здесь мы демонстрируем типичные иммунофлюоресценции методом для обнаружения и количественного определения γH2AX очагов в тканях мышей.
Protocol
Discussion
Для этой демонстрации мы использовали ткани легких мышей из необработанных Balb / с мышами и с мышиной модели хронические аллергические заболевания дыхательных путей. Мы количественно различия в количестве очагов на клетку с несколько более высокие средние наблюдается в поврежденных л…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержке австралийского Института ядерной науки и техники не будет подтверждено. TCK был удостоен AINSE наград. Эпигеномном Лаборатории медицины при поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (566 559). Л. М. поддерживается Мельбурне исследований (Университет Мельбурна) и биомедицинской визуализации стипендии CRC дополнительных. Поддержка Micro Монаш Imaging (доктора Стивена Коди и ISKA Кармайкл) был бесценен для этой работы. ММТ выражает благодарность за экспертную помощь и совет от д-р Ольга Седельникова из Национального института здоровья.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Referências
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
