Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido
Summary
Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.
Abstract
DNA double-strand breaks (LAP) são lesões particularmente letal e genotóxicas, que podem surgir tanto por processos endógenos (fisiológica ou patológica) ou por fatores exógenos, a radiação ionizante e compostos principalmente radiomimético. Fosforilação da variante histona H2A, H2AX, na serina-139 resíduos, na altamente conservada motivo SQEY C-terminal, formando γH2AX, é uma resposta inicial ao DNA de fita dupla-breaks<sup> 1</sup>. Este evento de fosforilação é mediada pela fosfatidil-inosito 3-quinase (PI3K) família de proteínas, ataxia telangiectasia mutantes (ATM), subunidade proteína-quinase DNA catalítico e ATM e Rad3 relacionados (ATR)<sup> 2</sup>. Globalmente, os resultados de indução DSB na formação de discreta nuclear γH2AX focos que podem ser facilmente detectadas e quantificadas por microscopia de imunofluorescência<sup> 2</sup>. Dada a especificidade e sensibilidade única deste marcador, a análise de focos γH2AX levou a uma ampla gama de aplicações em pesquisa biomédica, particularmente na biologia radiação e medicina nuclear. A quantificação de γH2AX focos tem sido mais amplamente investigado em sistemas de cultura celular no contexto de radiação ionizante induzida por LAP. Além da radiossensibilidade celular, imunofluorescência ensaios com base também foram usados para avaliar a eficácia da radiação modificando compostos. Além disso, γH2AX tem sido usada como um marcador molecular para examinar a eficácia de vários DSB indutores de compostos e foi recentemente anunciado como sendo importante marcador do envelhecimento e doenças, especialmente câncer<sup> 3</sup>. Além disso, os métodos baseados em imunofluorescência foram adaptados para atender a detecção e quantificação de γH2AX focos<em> Ex vivo</em> E<em> In vivo</em<sup> 4,5</sup>. Aqui, nós demonstramos um método típico de imunofluorescência para detecção e quantificação de γH2AX focos nos tecidos dos camundongos.
Protocol
Discussion
Para os fins desta demonstração foram utilizados a partir de tecido pulmonar do rato não tratada Balb / c infectados e de um modelo do rato de doenças crônicas das vias aéreas alérgicas. Nós quantificada diferenças no número de focos por célula com médias um pouco maior observada no pulmão danificado em comparação com seções não tratada. Especificamente, a quantificação indicou 6,5 por focos / célula e 9,4 focos por célula / (contagem manual de 20 células por seção), no tecido não tratados e de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O apoio do Instituto Australiano de Ciência Nuclear e Engenharia é reconhecido. TCK foi o ganhador de prêmios AINSE. Lab Medicine epigenômico é suportado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM é apoiada por Melbourne Research (University of Melbourne) e Biomedical Imaging bolsas complementares CRC. O apoio de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody e ISKA Carmichael) foi inestimável para este trabalho. MMT é grato pela assistência especializada e conselhos do Dr. Olga Sedelnikova do National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Referências
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
