In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie
Summary
Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.
Abstract
De studie van eiwit interacties in levende cellen is een belangrijk gebied van onderzoek, omdat de informatie verzameld zowel voordelen industriële toepassingen alsmede verhogingen elementaire fundamentele biologische kennis. Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) tussen een donor molecuul in een elektronisch aangeslagen toestand en een nabijgelegen acceptor molecuul is vaak gebruikt voor studies van eiwit-eiwit interacties in levende cellen. De eiwitten van belang zijn gelabeld met twee verschillende types van fluorescerende probes en uitgedrukt in biologische cellen. De fluorescerende probes worden dan enthousiast, meestal met behulp van laserlicht, en de spectrale eigenschappen van de fluorescentie-emissie afkomstig van de fluorescerende probes is verzameld en geanalyseerd. Informatie over de mate van het eiwit interacties is ingebed in de spectrale emissie-gegevens. Typisch, moet de cel worden gescand een aantal keren in om voldoende spectrale informatie verzamelen om nauwkeurig kwantificeren van de omvang van het eiwit interacties voor elke regio van belang binnen de cel. Echter, de moleculaire samenstelling van deze regio's te veranderen in de loop van de acquisitie-proces, het beperken van de ruimtelijke bepaling van de kwantitatieve waarden van de schijnbare FRET efficiëntie tot een gemiddelde over heel cellen. Door middel van een spectraal opgelost twee-foton microscoop, zijn wij in staat om een volledige set van spectraal opgelost beelden te verkrijgen na slechts een volledig excitatie scan van de steekproef van belang. Uit dit pixelniveau spectrale data, een kaart van FRET efficiëntie in de cel wordt berekend. Door het toepassen van een eenvoudige theorie van FRET in oligomere complexen aan de experimenteel verkregen verdeling van de FRET efficiëntie in de cel, een enkele spectraal opgelost scan onthult stoichiometrische en structurele informatie over het oligomeer complex onder te bestuderen. Hier beschrijven we de procedure voor de voorbereiding van biologische cellen (de gist Saccharomyces cerevisiae) uiten van membraan receptoren (steriele twee α-factor receptoren) gelabeld met twee verschillende types van fluorescerende probes. Daarnaast illustreren we kritische factoren die betrokken zijn bij het verzamelen van gegevens met behulp van fluorescentie de spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging systeem. Het gebruik van dit protocol kan worden uitgebreid tot elk soort eiwit dat kan worden uitgedrukt in een levende cel met een fluorescente marker in bijlage aan het bestuderen.
Protocol
Discussion
In deze presentatie, we geïllustreerd hoe de grootte en de structurele informatie over een eiwit oligomeer complex in vivo te bepalen. Terwijl gepresenteerde gegevens werden verkregen uit een specifiek membraan receptor (dwz Ste2p) uitgedrukt in gistcellen, de methode is allesomvattend in dat het kan worden toegepast op elk soort eiwit, uitgedrukt in elk type cel, de enige bepaling is dat de eiwitten zijn voorzien van tag met de juiste fluorescerende markers. Toekomstige wijzigingen van dit protocol zal omvatt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de UW-Milwaukee Research Groei-initiatief, de Wisconsin Instituut voor Biomedische Technologie en Gezondheid, en de Bradley Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
Referências
- Raicu, V., Diaspro, A. . Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. , (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. . Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. . , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
