In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie
Summary
Durch den Einsatz einer spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-System sind auf Pixel-Ebene Karten von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Wirkungsgrade für Zellen, die Membran-Rezeptoren angenommen, dass sie homo-oligomeren Komplexen Form erhalten. Von der Effizienz Karten FRET, sind wir in der Lage, stöchiometrische Informationen über die Oligomer-Komplex unter-Studie zu schätzen.
Abstract
Die Untersuchung von Protein-Interaktionen in lebenden Zellen ist ein wichtiger Bereich der Forschung, weil die Informationen sowohl Vorteile industrielle Anwendungen sowie Erhöhungen fundamentale biologische Wissen angesammelt. Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) zwischen einem Donor-Molekül in einem elektronisch angeregten Zustand und einem nahe gelegenen Acceptormolekül wurde häufig für Untersuchungen von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen eingesetzt. Die Proteine von Interesse sind mit zwei verschiedenen Arten von fluoreszierenden Sonden markiert und ausgedrückt in biologischen Zellen. Die fluoreszierenden Sonden werden dann angeregt, in der Regel mit Hilfe von Laserlicht und die spektralen Eigenschaften der Fluoreszenzemission, die aus der fluoreszierenden Sonden gesammelt und analysiert. Informationen über den Grad der Protein-Wechselwirkungen in der spektralen Emission Daten eingebettet. In der Regel muss die Zelle mehrmals gescannt werden, um genügend spektralen Informationen sammeln, um genau zu quantifizieren das Ausmaß der Protein-Interaktionen für jede Region von Interesse innerhalb der Zelle. Allerdings kann die molekulare Zusammensetzung dieser Regionen im Laufe des Erwerbs-Prozess zu ändern, wodurch die räumliche Bestimmung der quantitativen Werte der scheinbaren FRET Effizienzen auf durchschnittlich mehr als ganze Zellen. Durch eine spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskop, sind wir in der Lage, einen vollständigen Satz von spektral aufgelöste Bilder nach nur einem kompletten Scan Anregung der Probe von Interesse zu erhalten. Von diesem Pixel-Ebene spektralen Daten, FRET eine Karte von Effizienzen in der Zelle berechnet wird. Durch Anlegen einer einfachen Theorie von FRET in oligomeren Komplexen, die experimentell erhaltenen Verteilung der Effizienz der gesamten Zelle FRET, zeigt eine einzige spektral aufgelösten Scan stöchiometrischen und strukturelle Informationen über das Oligomer-Komplex unter-Studie. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Herstellung von biologischen Zellen (die Hefe Saccharomyces cerevisiae) zum Ausdruck Membranrezeptoren (steriles 2 α-Faktor-Rezeptoren) mit zwei verschiedenen Arten von fluoreszierenden Sonden markiert. Darüber hinaus zeigen wir kritische Faktoren bei der Erhebung Fluoreszenz Daten unter Verwendung der spektral aufgelösten Zwei-Photonen-Mikroskopie-Systems beteiligt. Die Verwendung dieses Protokolls kann verlängert werden, um jede Art von Protein, das in einer lebenden Zelle mit einem fluoreszierenden Marker angebracht, um es zum Ausdruck gebracht werden kann, zu studieren.
Protocol
Discussion
In diesem Vortrag dargestellt wir, wie man die Größe und strukturelle Informationen über ein Protein-Oligomer-Komplex in vivo zu bestimmen. Während die vorgestellten Daten aus einer bestimmten Membran-Rezeptor (dh Ste2p) in Hefe-Zellen exprimiert erhalten wurde, ist die Methode, allumfassend, dass sie auf jede Art von Protein in jeder Art von Zelle, die einzige Bedingung zum Ausdruck angewendet werden kann, dass die Proteine sind mit den entsprechenden fluoreszierenden Markern gekennzeichnet. Zukünftige Ä…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der UW-Milwaukee Forschung Wachstumsinitiative, die Wisconsin-Institut für Biomedizinische und Health Technologies, und der Bradley-Stiftung unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
Referências
- Raicu, V., Diaspro, A. . Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. , (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. . Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. . , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
