Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme
Summary
Işıksal çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak, piksel düzeyinde Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) verimlilik haritaları, homo-oligomerik komplekslerini oluşturmak için hipotez membran reseptörleri hücre elde edilir. Verimlilik haritaları FRET, çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik bilgi tahmin etmek mümkün.
Abstract
Canlı hücreler protein etkileşimleri çalışma, bilgi hem faydaları yanı sıra endüstriyel uygulamalar temel temel biyolojik bilgi artar birikmiş çünkü önemli bir araştırma alanıdır. Elektronik heyecanlı bir devlet bir bağış molekülü ve yakındaki bir alıcısı molekül arasında Förster (Floresan) Rezonans Enerji Transferi (FRET) canlı hücreler protein-protein etkileşimleri çalışmaları için sık sık kullanılmıştır. Ilgi proteinler, floresan probları iki farklı tipleri ile etiketlenen ve biyolojik hücreleri ifade edilir. Sonra floresan probları genellikle lazer ışığı kullanarak, heyecanlı, ve floresan probları yayılan floresan emisyon spektral özellikleri toplanmakta ve analiz edilmektedir. Protein etkileşimleri derecesi ile ilgili bilgiler, spektral emisyon verileri yerleştirilmiştir. Tipik olarak, hücre, hücre içindeki ilgi her bölge için protein etkileşimleri ölçüde doğru ölçmek için yeterli spektral bilgi biriktirmek için birkaç kez tarandıktan olmalıdır. Ancak, bu bölgelerde moleküler bileşimi tüm hücreleri üzerinde bir ortalama belirgin FRET verimlilikleri nicel değerler mekansal belirlenmesi sınırlayarak, satın alma sürecinin seyri sırasında değişebilir. Işıksal çözülmesi iki foton mikroskop sayesinde biz faiz örnek sadece bir uyarma tarama sonra Işıksal çözüme tam bir set görüntüleri elde edebiliyoruz. Bu piksel düzeyinde spektral veri, bir harita FRET hücre boyunca verimliliği hesaplanır. Deneysel olarak elde edilen dağıtım oligomerik komplekslerinde FRET basit bir teori uygulayarak hücre boyunca verimliliği FRET, tek bir Işıksal çözülmesi tarama çalışma kapsamında oligomer kompleksi hakkında stokiyometrik ve yapısal bilgiler ortaya koymaktadır. Burada floresan probları iki farklı tipleri ile etiketlenen membran reseptörleri (steril 2 α-faktörü reseptörleri) ifade biyolojik hücreleri (maya Saccharomyces cerevisiae) hazırlama prosedürü açıklar. Ayrıca, spektral çözülmesi iki foton mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılarak floresans veri toplama dahil kritik faktörler göstermektedir. Bu protokolün, bir floresan işaretleyici ile ona bağlı yaşayan bir hücre olarak ifade edilebilir protein her türlü çalışma uzatılabilir.
Protocol
Discussion
Bu sunumda, in vivo bir protein oligomer kompleksi hakkında boyutu ve yapısal bilgiler nasıl belirleneceği gösterilmiştir. Sunulan veriler, maya hücreleri ifade belirli bir membran reseptör (yani Ste2p) elde iken, yöntem herhangi bir hücre tipi, tek şart olarak ifade herhangi bir protein türüne uygulanabilir ki her şeyi kuşatan proteinler Uygun floresan işaretleri ile etiketlenir. Bu protokol gelecek değişiklikler zamana bağımlı protein oligomer boyutu ve yapısı değişiklikleri izlemek i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, UW-Milwaukee Araştırma Büyüme Girişimi Wisconsin Enstitüsü, Biyomedikal ve Sağlık Teknolojileri ve Bulut Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
Referências
- Raicu, V., Diaspro, A. . Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. , (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. . Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. . , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
