ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית
Summary
על ידי שימוש לפתור spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה מיקרוסקופית, פיקסל ברמה מפות של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) יעילות מתקבלים עבור תאים להביע את קולטני קרום השערה כדי ליצור הומו-oligomeric קומפלקסים. מן סריג מפות יעילות, אנו מסוגלים להעריך מידע stoichiometric על המתחם oligomer תחת מחקר.
Abstract
המחקר של אינטראקציות חלבון בתאים חיים הוא אזור חשוב של המחקר, כי המידע שהצטבר הן הטבות יישומים תעשייתיים כמו גם מגדיל בסיסי ידע ביולוגי בסיסי. פורסטר (הקרינה) תהודה העברת אנרגיה (סריג) בין מולקולת התורם במצב נרגש אלקטרונית מולקולה acceptor הסמוכים נוצל לעתים קרובות ללימודים של חלבונים אינטראקציות בתאים חיים. החלבונים של עניין מתויגים עם שני סוגים שונים של בדיקות ניאון והביע בתאים ביולוגיים. בדיקות פלורסנט שמחים אז, בדרך כלל באמצעות אור לייזר, ואת המאפיינים הרפאים של פליטת הקרינה הנובעות בדיקות ניאון הוא לאסוף ולנתח. מידע בדבר מידת האינטראקציות חלבון מוטבע נתוני פליטה ספקטרליים. בדרך כלל, התא חייב להיות סרק מספר פעמים על מנת לצבור מידע ספקטרלי מספיק כדי לכמת במדויק את היקף האינטראקציות חלבון עבור כל אזור של אינטרס בתוך התא. עם זאת, את ההרכב המולקולרי של אזורים אלה עשויים להשתנות במהלך תהליך הרכישה, להגביל את הנחישות המרחבית של ערכים כמותיים של סריג היעילות לכאורה בממוצע על פני התאים כולו. באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים spectrally נפתר, אנו מסוגלים להשיג סט מלא של תמונות נפתרה spectrally לאחר הסריקה אחד בלבד להשלים עירור של המדגם של עניין. מכאן פיקסל ברמה נתונים ספקטרליים, מפה של סריג יעילות ברחבי התא מחושב. על ידי יישום תיאוריה פשוטה של סריג מתחמי oligomeric חלוקת שהושגו בניסוי של סריג יעילות ברחבי התא, סריקה החליט spectrally אחד מגלה מידע stoichiometric מבניים על המתחם oligomer תחת מחקר. כאן אנו מתארים את הליך הכנת תאים ביולוגיים (cerevisiae Saccharomyces שמרים) להביע את קולטני קרום (סטרילי 2 α גורם קולטנים) מתוייגים עם שני סוגים שונים של בדיקות ניאון. יתר על כן, אנו ממחישים הגורמים הקריטיים המעורבים באיסוף נתונים באמצעות פלואורסצנציה החליטה spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה במיקרוסקופ. השימוש בפרוטוקול זה ניתן להאריך ללמוד כל סוג של חלבון אשר יכול לבוא לידי ביטוי בתא חי עם סמן פלואורסצנטי קשור אליו.
Protocol
Discussion
במצגת זו, הדגמנו כיצד לקבוע את גודל מידע מבניים מורכבים על חלבון oligomer in vivo. בעוד הנתונים שהוצגו התקבל קולטן קרום מסוים (כלומר Ste2p) הביע בתאי שמרים, השיטה היא חובקת כל בכך שהוא יכול להיות מיושם על כל סוג של חלבון לידי ביטוי לכל סוג של תא, התנאי היחיד הוא בכך את החלבונ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי יוזמת UW-מילווקי המחקר צמיחה, המכון ויסקונסין ביו טכנולוגיות הבריאות, קרן ברדלי.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | ||
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | ||
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | ||
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma Aldrich | Y2001 | ||
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | ||
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | ||
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | ||
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | ||
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | ||
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | ||
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon | |||
| Spectrally resolved two photon microscope |
Referências
- Raicu, V., Diaspro, A. . Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. , (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. . Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. . , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
