Microdissectie van Black Widow Spider Silk-producerende klieren
Summary
Hier beschrijven we een efficiënte strategie om de zijde-producerende klieren te verwijderen uit de buik van de vrouwelijke zwarte weduwe spinnen. Deze procedure maakt het mogelijk een snelle isolatie van de zeven verschillende zijde-producerende klieren in een sterk gezuiverd, mode, een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen spinnenzijde productie en assemblage vezels.
Abstract
Moderne spinnen draaien high-performance zijde vezels met een breed scala aan biologische functies, met inbegrip van voortbeweging, prooi te vangen en de bescherming van de ontwikkeling van nakomelingen 1,2. Spinnen deze taken uitvoeren door het draaien van een aantal verschillende soorten vezels die diverse mechanische eigenschappen hebben. Een dergelijke specialisatie van vezeltypen heeft plaatsgevonden door de evolutie van de verschillende zijde-producerende klieren, die fungeren als kleine biofactories. Deze biofactories fabriceren en op te slaan grote hoeveelheden van de zijde eiwitten voor vezelproductie. Door middel van een complexe reeks van biochemische gebeurtenissen, worden deze zijde eiwitten omgezet van een vloeistof in een vaste stof bij de extrusie.
Mechanische studies hebben aangetoond dat de spin zijde zijn sterker dan hoogwaardig staal 3. Analyses van de relatie tussen de structuur en functie van spin zijden draden te begrijpen is gebleken dat spindraad bestaat grotendeels uit eiwitten of fibroins, dat blok herhaalt hebben binnen hun eiwitsequenties 4. Gemeenschappelijke moleculaire handtekeningen die bijdragen aan de ongelooflijke treksterkte en uitbreidbaarheid van spider zijde worden ontrafeld door de analyses van vertaalde zijde cDNA's. Gezien de buitengewone eigenschappen van het materiaal van de spin zijde, zijn onderzoekslaboratoria over de hele wereld racen te begrijpen en de draaiende proces na te bootsen om synthetische zijde vezels voor commerciële, militaire en industriële toepassingen. Een van de belangrijkste uitdagingen voor spinning kunstmatige spindraad in het onderzoek lab gaat om een volledig inzicht in de biochemische processen die optreden tijdens de extrusie van de vezels van de zijde-producerende klieren.
Hier presenteren we een methode voor de isolatie van de zeven verschillende zijde-producerende klieren van de cobweaving zwarte weduwe spin, die de grote en kleine ampullate klieren bevat [produceert dragline en steigers zijde] 5,6, tubuliform [synthetiseert ei geval zijde] 7 , 8, flagelliform [onbekende functie in cob-wevers], aggregaat [maakt lijm zijde], aciniform [synthetiseert prooi inpakken en ei bij discussies] 9 en peervormig [produceert attachment schijf zijde] 10. Deze aanpak is gebaseerd op verlamming van de spin met koolzuurgas, na afscheiding van het kopborststuk van de buik, en microdissectie van de buik aan de zijde-producerende klieren te verkrijgen. Na de scheiding van de verschillende zijde-producerende klieren, kunnen deze weefsels worden gebruikt om verschillende macromoleculen voor verschillende biochemische analyses, met inbegrip van kwantitatieve real-time PCR, Noord-en West-blotting, massaspectrometrie (MS of MS / MS) analyses te identificeren op te halen nieuwe zijde eiwitsequenties, zoek naar eiwitten die deelnemen aan de zijde montage pad, of gebruik de intacte weefsel voor celkweek of histologische experimenten.
Protocol
Discussion
Onze methodologie voor de microdissectie van de zijde-producerende klieren van de zwarte weduwe spin biedt een effectief middel om zeer zuivere zijde-producerende klieren te verkrijgen. Dissecties kan worden voltooid in 1,5 tot 3 uur, waardoor een complete set van de zeven verschillende zijde-producerende klieren van cobweavers. Het verkrijgen van zeer zuivere zijde-klier samples maakt onderzoekers de mogelijkheid om een breed scala van biochemische studies, waaronder de identificatie van nieuwe zijde of chaperonn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een NSF RUI Grant MCB-0950372 recht moleculaire karakterisering van Black Widow Spider Silks.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium chloride | EM Science | SX0420-1 | 0.1 M in water | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D-5758 – 5 ml | 0.1% v/v | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 – 1 kg | 0.015 M in water | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | ||
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software – Leica Application Suite v2.8.1 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | ||
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S | |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 | |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm | |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological Supply Company | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
Referências
- Vollrath, F., Knight, D. P. . Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. . J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. . Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. . Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. . Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. . Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. . Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).
- Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. . Bioquímica. 44 (30), 10020-10020 (2005).
- Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. . J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. . Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. . J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).
