Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen
Summary
Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie, um die Seide produzierenden Drüsen aus dem Bauch der weiblichen Schwarzen Witwen zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Trennung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen in hochreiner Mode, ein wichtiger Prozess für die Ermittler Studium Spinnenseide Produktion und Faserverbund.
Abstract
Moderne Spinnen High-Performance-Seidenfasern mit einer breiten Palette von biologischen Funktionen, einschließlich Fortbewegung, Beutefang und zum Schutz der Entwicklung der Nachkommen 1,2. Spiders diese Aufgaben durch Spinnen mehrere verschiedene Fasertypen, dass diverse mechanische Eigenschaften aufweisen. Eine solche Spezialisierung der Fasertypen hat durch die Entwicklung der verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, die als kleine Biofabrik Funktion aufgetreten ist. Diese Biofabrik Herstellung und Lagerung von großen Mengen von Seidenproteinen für Faserproduktion. Durch eine komplexe Reihe von biochemischen Vorgängen, sind diese Seidenproteine von einer Flüssigkeit in einem festen Material nach der Extrusion umgewandelt.
Mechanische Untersuchungen haben gezeigt, dass Spinnenseide stärker als hochfestem Stahl 3 sind. Analysen, um die Beziehung zwischen der Struktur und Funktion der Spinnenseide Themen verstehen haben ergeben, dass Spinnenseide zum größten Teil aus Proteinen oder Fibroine, dass Block wiederholt haben im Rahmen ihrer Proteinsequenzen 4 besteht. Gemeinsame molekulare Signaturen, die die unglaubliche Zugfestigkeit und Dehnbarkeit von Spinnenseide beitragen werden durch die Analysen der übersetzten Seide cDNAs entwirrt. Angesichts der außergewöhnlichen Materialeigenschaften von Spinnenseide sind Forschungslabors auf der ganzen Welt Rennen zu verstehen und zu imitieren das Spinnverfahren für synthetische Seidenfasern für kommerzielle, militärische und industrielle Anwendungen. Eine der größten Herausforderungen für die Spinnerei künstliche Spinnenseide im Forschungslabor beinhaltet ein vollständiges Verständnis der biochemischen Prozesse, die während der Extrusion der Fasern von der Seiden-produzierenden Drüsen auftreten.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von den sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen aus der cobweaving Schwarze Witwe, die die großen und kleinen Ampullendrüse Drüsen enthält [fertigt dragline und Gerüste Seide] 5,6, tubuliform [synthetisiert Eihülle Seide] 7 , 8, flagelliform [unbekannter Funktion in cob-Weber], aggregieren [macht Leim Seide], aciniform [synthetisiert Beute Verpackung und Eihülle Themen] 9 und birnenförmig [produziert Befestigung Disc Seide] 10. Dieser Ansatz basiert auf betäuben die Spinne mit Kohlendioxid-Gas, anschließende Trennung der Cephalothorax aus dem Bauch, und Mikrodissektion des Bauches, die Seiden-produzierenden Drüsen zu erhalten basiert. Nach der Trennung der verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, können diese Gewebe verwendet, um verschiedene Makromoleküle für verschiedene biochemische Analysen, einschließlich der quantitativen real-time PCR, Northern-und Western-Blot analysiert Massenspektrometrie (MS oder MS / MS) zu identifizieren abgerufen werden New Silk Protein-Sequenzen, Suche nach Proteinen, die in die Seide Montage Weg zu beteiligen, oder verwenden Sie das intakte Gewebe für die Zellkultur oder histologische Untersuchungen.
Protocol
Discussion
Unsere Methodik für die Mikrodissektion der Seiden-produzierenden Drüsen aus der schwarzen Witwe bietet ein wirksames Mittel zu hoch gereinigten Seide produzierenden Drüsen zu erhalten. Dissektionen können in 1,5 bis 3 Stunden abgeschlossen sein, was zu einem kompletten Satz der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen aus cobweavers. Beziehen hochgereinigtes Seide-Drüse Proben ermöglicht Forschern die Möglichkeit, ein breites Spektrum an biochemischen Untersuchungen, einschließlich der Identifizierung…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium NSF RUI MCB-0950372 mit dem Titel Molekulare Charakterisierung von Black Widow Spinnenseidenproteinen unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium chloride | EM Science | SX0420-1 | 0.1 M in water | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D-5758 – 5 ml | 0.1% v/v | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 – 1 kg | 0.015 M in water | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | ||
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software – Leica Application Suite v2.8.1 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | ||
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S | |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 | |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm | |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological Supply Company | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
Referências
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