Microdissection de Black Widow Soie d'araignée des glandes productrices
Summary
Nous décrivons ici une stratégie efficace pour enlever les glandes produisant la soie de l'abdomen des femelles veuves noires. Cette procédure permet l'isolement rapide de la production de soie sept glandes distinctes d'une manière hautement purifiée, un processus important pour les enquêteurs étudient la production de soie d'araignée et de l'assemblage de fibres.
Abstract
Araignées modernes tour des fibres de soie de haute performance avec une large gamme de fonctions biologiques, y compris la locomotion, la proie saisie et la protection de développer 1,2 progéniture. Araignées accomplir ces tâches en faisant tourner plusieurs types de fibres distinctes qui ont diverses propriétés mécaniques. Une telle spécialisation des types de fibres a eu lieu à travers l'évolution des différentes glandes productrices de soie, qui fonctionnent comme des bio-usines de petite taille. Ces bio-usines de fabrication et de stocker de grandes quantités de protéines de soie pour la production de fibres. Grâce à une série complexe d'événements biochimiques, ces protéines de soie sont convertis à partir d'un liquide dans un matériau solide lors de l'extrusion.
Des études ont démontré que mécanique soies d'araignée sont plus forts que l'acier à haute résistance 3. Analyses de comprendre la relation entre la structure et la fonction des fils de soie d'araignée ont révélé que la soie d'araignée se compose essentiellement de protéines, ou fibroins, qui ont dans leurs répète bloc de séquences de protéines 4. Commune signatures moléculaires qui contribuent à la résistance à la traction incroyable et l'extensibilité de la soie d'araignée sont démêlé au travers des analyses d'ADNc de soie traduits. Etant donné les propriétés du matériau extraordinaire de soies d'araignée, les laboratoires de recherche à travers le monde font la course à comprendre et à imiter les processus de filage pour produire des fibres de soie synthétique pour des applications commerciales, militaires et industriels. Un des principaux défis à la filature de la soie d'araignée artificielle dans le laboratoire de recherche implique une compréhension complète des processus biochimiques qui se produisent lors de l'extrusion des fibres provenant des glandes de soie producteurs.
Nous présentons ici une méthode pour l'isolement des sept producteurs de soie différentes glandes de l'araignée veuve noire cobweaving, qui comprend les glandes ampullate majeurs et mineurs [fabrique de soie et d'échafaudages dragline] 5,6, tubuliform [synthétise la soie cas d'œuf] 7 , 8, flagelliformes [fonction inconnue en torchis-tisserands], granulats [rend la soie colle], acinus [emballage proies synthétise et les discussions à oeufs] 9 et piriformes [produit l'attachement de la soie disque] 10. Cette approche est basée sur anesthésier l'araignée avec du gaz de dioxyde de carbone, la séparation ultérieure du céphalothorax de l'abdomen, et microdissection de l'abdomen afin d'obtenir les glandes produisant la soie. Après la séparation des différentes glandes productrices de soie, ces tissus peuvent être utilisés pour récupérer des macromolécules différentes pour différentes analyses biochimiques, y compris quantitative PCR en temps réel, dans le nord-ouest et le buvard, spectrométrie de masse (MS ou MS / MS) des analyses pour identifier nouvelles séquences de protéines de soie, la recherche de protéines qui participent à la voie d'assemblage de soie, ou utiliser les tissus intacts pour la culture cellulaire ou d'expériences histologiques.
Protocol
Discussion
Notre méthodologie pour la microdissection des glandes produisant la soie de l'araignée veuve noire offre un moyen efficace d'obtenir hautement purifiées de la soie des glandes productrices. Les dissections peuvent être complétés dans 1,5 à 3 heures, ce qui donne un ensemble complet de sept distincts de soie des glandes productrices d'cobweavers. Obtention hautement purifiées de la soie de la glande échantillons permet aux enquêteurs la possibilité d'effectuer un large éventail d'études …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention NSF RUI MCB-0950372 Caractérisation moléculaire droit de Black Silks Veuve.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium chloride | EM Science | SX0420-1 | 0.1 M in water | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D-5758 – 5 ml | 0.1% v/v | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 – 1 kg | 0.015 M in water | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | ||
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software – Leica Application Suite v2.8.1 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | ||
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S | |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 | |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm | |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological Supply Company | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
Referências
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