Summary
这个协议描述一个过程来研究从骨骼肌中分离出的线粒体呼吸。这种方法改编自Scorrano
Abstract
线粒体是细胞器控制细胞死亡的生命和。他们参与重要的代谢反应，合成的ATP，规范的信号级联 2,3 。过去和目前研究人员已经从大鼠和小鼠的组织，如肝，脑和心脏4,5中分离出线粒体。近年来，许多研究人员都集中在研究从骨骼肌线粒体功能。
在这里，我们描述了，我们已经成功地用于从 6骨骼肌线粒体隔离的方法。我们的程序要求，所有的缓冲液和试剂都取得了新的和需要约250-500毫克骨骼肌。我们研究了从大鼠和小鼠腓肠肌和隔膜中分离出线粒体，鼠眼外肌。线粒体蛋白浓度测定Bradford法。重要的是保持在编制和功能的研究是一个相对较短的时间（约1小时）内进行线粒体样品冰冷。线粒体呼吸是用一个克拉克型电极（Oxygraph系统）在37 ° C 7极谱。氧电极的校准是在本议定书中的关键一步，它每天必须执行。隔离线粒体（150微克）被添加到实验缓冲液（EB）0.5毫升。国家2呼吸开始，除谷氨酸（5MM）和苹果酸（2.5毫米）。然后，二磷酸腺苷（ADP）（150微米）被添加到启动状态3。寡（1μM），ATP酶合成酶阻断剂，用于估计状态4。最后，羰基氰化物的P -三氟甲氧基] -苯基腙（FCCP，0.2微米）添加到measurestate 5，或耦合呼吸 6 。呼吸控制率（RCR），状态3状态4的比例，计算后，每一个实验。 RCR≥4被认为是一个可行的线粒体准备的证据。
总之，我们目前的隔离，可用于生化（例如，研究酶的活性，免疫检测，蛋白质组学）和功能（线粒体呼吸）的骨骼肌线粒体可行的方法。
Protocol
1。缓冲区的制备
- 开启离心机5804R，并设置为4 ° C。 Isotemp 3006D水浴，并设置转到37 ° C
- 肌肉隔离前的准备以下解决方案：
- PBS：磷酸盐缓冲液（PBS）药片溶解在蒸馏水（5片/升）。拌匀。
- PBS加10 mM的EDTA：要准备100毫升溶液，添加98毫升的PBS 2毫升500毫米EDTA。
- 8X线粒体缓冲液：蔗糖10.28克终浓度为0.6米，400毫克的自由脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）终浓度为0.8％，为160毫米的终浓度2.08克HEPES，pH值7.4和QS至50毫升，用蒸馏水。
- 隔离缓冲1（IB1）：加入200μL500 mM的EDTA的终浓度为10毫米，0.392克终浓度为215毫米D -甘露醇，8X线粒体缓冲液，pH 1.25毫升至7.4和QS至10毫升，用蒸馏水。
- 隔离缓冲2（IB2）：加入终浓度为3毫米，0.392克终浓度为215毫米D -甘露醇，8X线粒体缓冲液，pH 1.25毫升至7.4和QS 60至10μL500毫米EGTA毫升，用蒸馏水。
- 实验缓冲液（EB）：加入终浓度为100μLMgCl 2的 500毫米的终浓度为5毫米，0.392克终浓度为215毫米D -甘露醇，25微升2.5毫米KH 2 PO 4 6.25微米，2个100毫米EGTAμL终浓度为20微米，1.25毫升线粒体缓冲液，pH为7.4和QS至10毫升，用蒸馏水。
2。肌肉隔离
- 在冰桶中，把3个10毫升的烧杯中，波特Elvehjem组织磨床和其他一切必要的仪器/用品上冰。整个实验过程中的一切都必须保持冰冷。
- 放置在冰桶和温水浴EB IB1和IB2完成时的场所。
- 在三个10毫升的烧杯中，应增加以下解决方案：
- 烧杯1：10毫升的PBS
- 烧杯2：10毫升的PBS / EDTA
- 烧杯3：3毫升IB1
- 杀死老鼠人道本地机构的动物护理和使用委员会批准。
- 迅速隔离骨骼肌250-500毫克，在烧杯1冲洗，然后转移到烧杯2。
3。同质化/线粒体隔离
- 肌肉转移到烧杯3和精细直言不讳地用剪刀肌肉。
- 传输的解决方案，以波特Elvehjem匀浆。均质使用机动杵（一台钻床，会做的工作）的10倍，在任何时候都保持在冰管的肌肉。
- 转移匀浆在700 克 10分钟，在4 ° C预冷的2毫升离心管和离心机
- 上清转移到一个新的预冷的离心管。弃去沉淀。
- 上清离心10分钟，在10500 克 ，4 ° C 。
- 上清转移到一个新的预冷的离心管和标签SN1（上清1号）和肌肉类型。
- 重悬在500μL的IB2颗粒。
- 离心10分钟，在10500 克在4 ° C。
- 上清转移到一个新的预冷的离心管和标签SN2（上清2）和肌肉类型。
- 暂停在100μL的IB2最终线粒体颗粒。
- 重新自旋最终线粒体悬浮在minifuge几秒钟。如果有颗粒，转移上清到一个新的预冷的离心管，弃去沉淀。
- 确定蛋白浓度用Bradford检测8。
4。电极校准
注：在线粒体隔离期间完成电极校准。
- 加入100毫升蒸馏水至250毫升容量瓶中。大力搅拌20分钟，以平衡水与大气中的气体。
- 添加几滴50％氯化钾Oxygraph电极。
- 放置一个电极上的一小块蓝Rizla卷烟纸。
- PTFE膜放置一块卷烟纸的顶部。
- 申请使用环撒施，然后放置在电极槽外圈内圈。
- 连接电极和组装其他设备：较大的塑料环基地，线粒体室，水管。
- Oxygraph箱打开，并启动Oxygraph软件。
- 平衡水线粒体室。
- 搅拌棒和打开速度为60。
- 开始一个新的实验。
- 点击“校准”和液相校准框1。变温度至37 ° C，然后单击“确定”两次。
- 当“覆盖”转变到“确定”点击它，打开氮气罐。
- 广场一角相连氮气罐室，并建立零氧。点击“OK”时，从开关“覆盖。”
- 吸干水和线粒体商会的EB缓冲液加入500μL。
- 密封腔与柱塞。
- 如果使用多个盒子，重复步骤11-15校准盒2。
5。线粒体呼吸
- 开始一个新的实验，让它运行约1分钟，以稳定的信号。
- 添加必要的线粒体悬液量（步长3.11），为150微克每一个分庭，标志事件，并让它运行1分钟。
- 加入10μl的温暖250 mM/125 mM的谷氨酸/苹果酸终浓度为5 mM/2.5毫米。马克和让运行1分钟。这是定义为国家2。
- 加入终浓度为150微米，马克7.5μL10 mM的ADP公司，并让运行了30秒。这被定义为国家3。
- 添加另有10毫米ADP，马克7.5μL，让运行1.5分钟。
- 加入终浓度为1微米，马克0.5μL冷10毫米寡，让运行3分钟。这被定义为国家4。
- 加入终浓度为0.2微米，马克1μL0.1 mM的FCCP冷，让运行3分钟。这是定义为5国。
- 完成后，结束实验，并保存。
- 获取使用Oxygraph软件的呼吸速率。
- 进入正常化的因素：如果添加150微克的线粒体蛋白，正常化的因素将是0.15。
- 规范化呼吸率计算出不同的呼吸状态。
- 计算除以3国4国的呼吸控制率（RCR）。
6。代表性的成果：
图1显示了一个代表骨骼肌线粒体消耗氧气的跟踪。电极信号稳定后，线粒体样品添加到Oxygraph室。国家2呼吸开始除了与谷氨酸和苹果酸。此外ADP的增加氧的消耗，定义状态3呼吸。 ATP合酶阻断寡此外，获得国家4呼吸。最后，FCCP添加到解耦线粒体呼吸（状态5）， 表1显示了国2，3，4和5代表氧的消耗率。呼吸控制率（RCR）是计算每个实验。 RCR≥4被认为是一个可行的线粒体准备的证据。
国家 | 归价格 |
状态2 | 34.74 |
状态3 | 153.40 |
国家4 | 16.49 |
国5 | 143.70 |
RCR | 9.30 |
表1。线粒体呼吸速率。Representativeoxygen骨骼肌线粒体的消费率。值进行归一室线粒体的添加量。呼吸控制率（RCR），是由分裂状态3状态4。 RCR≥4代表一个可行的线粒体准备。
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Discussion
我们提出了一个协议孤立可行的骨骼肌线粒体。如果收益率是一个问题，该协议可以修改孵化5毫升30分钟，在冰PBS/10mM EDTA/0.01％胰蛋白酶的孤立肌肉。为了保证胰蛋白酶完成肌肉消化，肌肉需要充分剁碎。 PBS/10mM EDTA/0.01％胰蛋白酶溶液孵育30分钟后，必须完全取代隔离缓冲区1（IB1）3毫升。此外，使用胰蛋白酶，可能会干扰线粒体呼吸协议中的一些基板。这一协议处于良好的使用胰蛋白酶时线粒体准备的结果在所有使用的基板。
对于小鼠骨骼肌，它是最好的结合两条腿腓肠肌，或使用整个隔膜。对于大鼠骨骼肌，腓肠肌或隔膜的一小部分就足够了。过度的肌肉质量，产量降低复杂的分离过程和结果。对于非常小的肌肉，如眼外肌的隔离，它是从1个多动物要池肌肉，以获得必要的的肌肉质量。
该协议是指两个不同的上清：SN1和SN2。这些上清差速离心和包含非线粒体的蛋白质。从这些上清，从最终的线粒体颗粒的蛋白质可用于免疫印迹验证线粒体制剂的纯度。利用线粒体和细胞质抗体蛋白印迹确认您的线粒体准备在最后的颗粒的纯度。
清洁线粒体呼吸设备，是一个成功的实验关键。每次实验后，必须彻底清洗商会如下：用蒸馏水冲洗商会五次，一次冲洗干净，用70％乙醇去除溶于乙醇基板，一个约5分钟的PBS / BSA的饱和溶液冲洗，最后，用蒸馏水冲洗商会的5倍。克拉克型电极必须正确清洗使用后，每用蒸馏水冲洗几次，用牙刷轻轻擦洗。然后，他们必须完全干燥与借给无湿巾和储存在干燥器中。每周一次，应打磨电极使用Oxygraph抛光套件。
线粒体基板准备股票的解决方案，分装和储存在-20℃。我们不建议承印物的再利用。根据我们的经验，大部分基材稳定在-20℃的数个月，除寡，必须更换每隔2个月左右。请务必参阅有关详细信息，制造商的规格。
最后，这个协议也可以被用来隔离心脏线粒体。至于其他肌肉，大小的动物（鼠与鼠标）将确定什么样的器官的一小部分是要获得足够的线粒体的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由一个由美国国家眼科研究所（R01 EY12998）授予FH安德拉德支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local Gas Supplier | ||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| Compressed nitrogen | Local Gas Supplier | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | ||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 |
References
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