Summary
पूरे माउंट
Protocol
1. सीडीएनए लक्ष्य के प्लाज्मिड परिवर्तन
भाग मैं: प्लाज्मिड के परिवर्तन
(आवश्यक टाइम: 3 घंटे से अधिक रातोंरात ऊष्मायन)
- एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म समाज पोषक तत्व शोरबा (500 μL प्रति प्रतिक्रिया)
- बर्फ पर सक्षम कोशिकाओं को पहले गला लें
- 1 25 μL सक्षम कोशिकाओं को प्लाज्मिड μL जोड़ें
- 20 मिनट के लिए बर्फ पर रखें
- हीट 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 45 सेकंड के लिए सदमे कोशिकाओं
- तुरंत बर्फ पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं जगह
- कोशिकाओं के प्रत्येक शीशी को 42 डिग्री सेल्सियस पोषक तत्व शोरबा के 500 μL जोड़ें
- 37 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट 255 घुमाव पर 2 घंटे के लिए (rpm) पर हिलाएँ
- प्लेट 75 Luria Bertani (पौंड) अगर प्लेटों पर μL परिवर्तन मिश्रण
- सेते प्लेटें 37 पर औंधा ° रातोंरात सी
भाग द्वितीय: ई. कोलाई संस्कृति
(आवश्यक टाइम: 15 मिनट से अधिक रातोंरात ऊष्मायन)
- प्रत्येक प्रतिक्रिया, विभाज्य 3 एमएल लेग शोरबा संस्कृति ट्यूब में और 50 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन 3 μL के लिए
- अगर थाली से 1 बैक्टीरिया कॉलोनी परिमार्जन और प्रत्येक संस्कृति ट्यूब को जोड़ने
- 37 में संस्कृति ट्यूबों हिलाएँ ° सी में 255 rpm रातोंरात
प्लाज्मिड तैयारी: भाग III
(आवश्यक टाइम: 1.5 घंटे)
- रातोंरात 5 प्रधानमंत्री FastPlasmid मिनी किट (२३,००,००० # सूचि) का उपयोग संस्कृतियों से प्लाज्मिड पृथक
- तैयार प्लाज्मिड की उपस्थिति के लिए जाँच करने के लिए, 1% Tris-एसीटेट EDTA (TAE) ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग जेल पर किट से eluted डीएनए चलाने
2. स्वस्थानी डीआईजी लेबल शाही सेना जांच संश्लेषण में
भाग मैं: प्लाज्मिड के linearization
(आवश्यक टाइम: 2.5 घंटे)
- एक 1.5 एमएल microfuge ट्यूब में गठबंधन:
प्लाज्मिड तैयार 20 एमएल प्रतिबंध एनजाइम * 2 एमएल बफर ** 10 एमएल 10X गोजातीय सीरम albumin (BSA) 10 एमएल Diethyl Pyrocarbonate जल (DEPC) 58 एमएल 100 एमएल - 37 ° 2 घंटे के लिए सी सेते
* प्लाज्मिड के साथ बदलता रहता है
** प्रतिबंध एंजाइम के साथ बदलता रहता है
भाग द्वितीय: ट्रांसक्रिप्शन
(आवश्यक टाइम: 3 घंटे)
- एक 1.5 एमएल microfuge ट्यूब में गठबंधन:
प्लाज्मिड रैखिक 4 एमएल 10X ट्रांसक्रिप्शन बफर ** 4 एमएल Digoxigenin लेबल मिक्स 4 एमएल पोलीमरेज़ * 2 एमएल RNase अवरोध करनेवाला 2 एमएल DEPC जल 24 एमएल 40 एमएल - 1 घंटे के लिए 37 ° C पर सेते
- पोलीमरेज़ * 2 μL जोड़ें
- 1 घंटे के लिए 37 ° C पर सेते
- DNase के 2 μL जोड़ें
- 37 में सेते ° 20 मिनट के लिए सी
* प्लाज्मिड के साथ बदलता रहता है
** पोलीमरेज़ के साथ बदलता रहता है
भाग III: वर्षा
समय (आवश्यक: 5 मिनट रातोंरात ऊष्मायन, 1 घंटे के लिए प्लस 2 घंटे अपकेंद्रित्र करने के लिए और फिर से निलंबित)
- 0.2M EDTA के 4 μL जोड़ें
- 4M लिथियम क्लोराइड के 5 μL जोड़ें
- बर्फ के ठंडे 100% इथेनॉल के 150 μL जोड़ें
- -80 ° 2 घंटे के लिए सी रात भर के लिए सेते
- 30 मिनट के लिए 14,000 rpm पर 4 डिग्री सेल्सियस, छानना दूर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र
- 7 मिनट के लिए सूखी गोली
- 20 μL DEPC पानी में पुनः निलंबित
- 37 में सेते ° 5 मिनट के लिए सी
भाग IV: Fractionation - प्रदर्शन सिर्फ अगर जांच आकार 0.6 केबी से अधिक है
(आवश्यक समय: जांच के आकार के आधार पर भिन्न है, आमतौर पर कोई अधिक से अधिक 20 मिनट)
- एक 1.5 एमएल microfuge ट्यूब में गठबंधन:
शाही सेना जांच 20 एमएल DEPC जल 12 एमएल सोडियम बिकारबोनिट 4 एमएल सोडियम कार्बोनेट 4 एमएल 40 एमएल - एक 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं. समीकरण पर ऊष्मायन समय बेस:
समय (यूके) = (केबी शुरू वांछित केबी) / (0.11 केबी एक्स शुरू एक्स वांछित केबी)
औसत इच्छित आकार = 0.6 केबी
भाग वी अंतिम वर्षा:
(आवश्यक समय: 5 मिनटutes रातोंरात ऊष्मायन, 1 घंटे के लिए प्लस 2 घंटे अपकेंद्रित्र और फिर निलंबित, जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए 1 घंटा)
- 40 μL DEPC पानी जोड़ें
- 8 μL सोडियम एसीटेट जोड़ें
- 1.04 μL हिमनदों एसिटिक एसिड जोड़ें
- 240 μL बर्फ ठंड 100% इथेनॉल जोड़ें
- -80 ° 2 घंटे के लिए सी रात भर के लिए सेते
- 30 मिनट के लिए 14,000 rpm पर 4 डिग्री सेल्सियस, छानना दूर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र
- 7 मिनट के लिए सूखी गोली
- 20 μL DEPC पानी में पुनः निलंबित
- मिश्रण भंवर
- Riboprobe की उपस्थिति के लिए जाँच करने के लिए, एक 1% TAE जेल दाग पर ethidium ब्रोमाइड के साथ पुनः-निलंबित समाधान चलाने
3. स्वस्थानी संकरण में पूरा पर्वत
भाग मैं: भ्रूण का निर्धारण और proteinase कश्मीर पाचन
(आवश्यक समय: फिक्स रातोंरात अधिक 4 घंटे के भंडारण के लिए अगले दिन, 2.5 घंटे का भंडारण से भाग II)
- Zebrafish भ्रूण मंचन लीजिए और 4 में 4% paraformaldehyde (पीएफए) में रातोंरात ठीक डिग्री सेल्सियस
- फॉस्फेट में तय भ्रूण धो खारा buffered 0.1% 10 मिनट प्रत्येक के लिए बीच - 20 (PBSt) 3 बार युक्त
- भ्रूण की प्रयोगात्मक अभिकर्मकों, मैन्युअल dechorionate भ्रूण (यदि आवश्यक) ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग करने के लिए जोखिम की गारंटी
- 25% की एक वर्गीकृत श्रृंखला में कपड़े धोने और PBSt में 50% मेथनॉल एक घंटे के लिए प्रत्येक धोने के द्वारा भ्रूण निर्जलीकरण, तो -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल में स्टोर
- जब का उपयोग करने के लिए तैयार है, 50% (2 बार) और 25 (1 बार)% 10 मिनट प्रत्येक के लिए PBSt में मेथनॉल में धोने से PBSt में भ्रूण rehydrate. अंत में 10 मिनट प्रत्येक के लिए 100% PBSt में 2 बार धो लो. सटीक समय PBSt / मेथनॉल washes के लिए महत्वपूर्ण नहीं है
- PBSt में एक 10% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान यदि आवश्यक हो, काले pigments हटायें में ब्लीच भ्रूण. भ्रूण 10-20 मिनट के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान में सेते हैं, भ्रूण की उम्र पर निर्भर करता है चाहिए, और microfuge ट्यूब की टोपी हवा के दबाव के निर्माण को रोकने के खुले रहते हैं चाहिए
- 50 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर के साथ डाइजेस्ट भ्रूण PBSt में 3-15 मिनट के लिए 1:5000, पतला भ्रूण की उम्र पर निर्भर करता है
- 30 मिनट के लिए 4% पीएफए में पुनः तय भ्रूण, और फिर PBSt में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धो
भाग द्वितीय Riboprobes के संकरण:
(आवश्यक टाइम: 3 घंटे से अधिक के लिए रात में संकरण, 1.5 घंटे भाग III के लिए अगले दिन)
- एक preheated डिग्री सेल्सियस पानी से स्नान 70 में prehybridization समाधान (PHS) के साथ 2-3 घंटे के लिए भ्रूण Prehybridize
- PHS निकालें, 0.5 एमएल संकरण समाधान और 1.5 μL पहले संश्लेषित Digoxigenin लेबल riboprobes, 70 ° रातोंरात सी सेते जोड़ें. तापमान riboprobe लक्ष्य पर कुछ निर्भर करता है डिग्री के भीतर उतार चढ़ाव हो सकते हैं
- अगले दिन, 70 भ्रूण धोने ° सी 75%, 50%, और 25% 10 मिनट प्रत्येक के लिए 2X खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) में PHS वर्गीकृत समाधान में है, तो 30 मिनट के लिए 0.2X एसएससी में 68 पर धो ° सी
- कमरे के तापमान पर Maleic एसिड (एमएबी) बफर 2 बार में 10 मिनट प्रत्येक के लिए धो
भाग III: (α डीआईजी) विरोधी Digoxigenin एंटीबॉडी ऊष्मायन
(आवश्यक टाइम: 3 घंटे से अधिक ब्लॉक करने के लिए रात भर, 2.5 घंटे भाग चतुर्थ करने के लिए अगले दिन)
- एक 12 अच्छी तरह से थाली करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण
- कमरे के तापमान पर कम से कम 3 घंटे के लिए पूर्व ब्लॉक 1-2 एमएल अवरुद्ध समाधान में भ्रूण
- इसके साथ ही, अवरुद्ध समाधान का एक दूसरा खंड की तैयारी और इस समाधान में विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी 1:2000 गिराए द्वारा एंटीबॉडी पूर्व ब्लॉक
- पूर्व ब्लॉक निकालें और 1-2 एमएल पूर्व अवरुद्ध α-डीआईजी समाधान जोड़ने के लिए, 4 में रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
- अगले दिन, एमएबी में भ्रूण धो लो. भ्रूण एमएबी में पहली 5 मिनट के लिए सेते के लिए अनुमति दें, तो बफर परिवर्तन करने और दो 10 मिनट, एक 30 मिनट और एक 60 मिनट के अंतराल के लिए सेते हैं. सही समय आवश्यक नहीं है
- भ्रूण alkaline फॉस्फेट बफर (एपी) में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धो
भाग IV: धुंधला और अंतिम प्रसंस्करण
समय (आवश्यक: 1 घंटे, धुंधला के लिए रात में इस्तेमाल किया riboprobe पर निर्भर करता है, ग्लिसरॉल washes, ग्लिसरॉल धोने प्रति 6-10 घंटे, की शुरुआत 4 घंटे ग्लिसरॉल में संग्रहीत किया जा सकता है)
- 1-2 एमएल धुंधला समाधान भ्रूण को जोड़ें, पन्नी में थाली लपेटो, और (के बारे में हर 20 मिनट) नियमित अंतराल पर धुंधला की जांच जब तक धुंधला हो जाना पर्याप्त है
- PBSt 5 मिनट प्रत्येक के लिए 2 बार के साथ भ्रूण धो धुंधला प्रतिक्रिया को रोकने के
- 25% में 10 मिनट washes (1 बार) और 50 (2 बार)% PBSt में मेथनॉल, 100% मेथनॉल में तो प्रयोग भ्रूण निर्जलीकरण, पृष्ठभूमि धुंधला हटायें
- भ्रूण 100% मेथनॉल में कम से कम 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते करने के लिए अनुमति दें
- PBSt में 50% में 10 मिनट washes (2 बार) और 25 (1 बार)% PBSt में मेथनॉल का उपयोग rehydrate, तो 100% में PBSt 2 बार धो
- दाग ई हस्तांतरणPBSt में एक 80% ग्लिसरॉल समाधान के लिए mbryos, 4 में washes के एक वर्गीकृत श्रृंखला है, और दुकान का उपयोग डिग्री सेल्सियस
व्यंजनों:
- लेग अगर छ लेग + अगर 250 एमएल आसुत पानी, आटोक्लेव, 10 प्लेटें जब छूने के लिए अच्छा 250 μL एम्पीसिलीन जोड़ने के लिए, प्रत्येक पेट्री डिश में 15-20 एमएल गर्म समाधान डालना, अगर जमना करने की अनुमति
- लेग बाइ शोरबा 12.5 छ लेग शोरबा + 200 एमएल आसुत जल, आटोक्लेव, उपयोग करने से पहले शांत करने की अनुमति
- % 1 TAE जेल 0.4 छ agarose, 40 एमएल 1X TAE, 2 μL ethidium ब्रोमाइड; लोड 7 μL (सीडीएनए लक्ष्य के परिवर्तन प्लाज्मिड) प्लाज्मिड या 3 μL riboprobe और 4 μL DEPC पानी (सीटू डीआईजी लेबल शाही सेना जांच संश्लेषण में) + 1 μL लोड हो रहा है डाई, 5 μL डीएनए सीढ़ी
- Prehybridization समाधान 50% formamide, 5X एसएससी, 9.2mM साइट्रिक एसिड, 1% बीच 20
- संकरण समाधान prehybridization समाधान प्लस 500 μg / एमएल tRNA और 50 μg / एमएल हेपरिन
- MAB-100mm Maleic एसिड, 150mm NaCl, 0.2M NaOH, 0.1% बीच 20, 7.5 पीएच
- अवरुद्ध समाधान 3 भागों MAB, भाग 1 एमएबी में 10% Boehringer अवरुद्ध अभिकर्मक, भेड़ का बच्चा भाग 1 गर्मी सीरम निष्क्रिय
- एपी बफर-60mm Tris - एचसीएल 9.5 पीएच, 60mm NaCl, 30mm MgCl 2, 0.1% बीच 20
- धुंधला समाधान 5-Bromo-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl (BCIP) फॉस्फेट और नाइट्रो नीले रंग में tetrazolium (एनबीटी) एपी बफर
4. प्रतिनिधि परिणामों
जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, एनबीटी, BCIP, और alkaline फॉस्फेट के बीच प्रतिक्रिया एक बैंगनी वेग है कि zebrafish भ्रूण पर एक बैंगनी दाग के रूप में प्रकट करना चाहिए फार्म का होगा. Riboprobes पहले ब्याज की जीन के लिए इसी सीडीएनए से संश्लेषित किया जाना चाहिए. इसलिए, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है किसी भी दाग कल्पना zebrafish के क्षेत्रों में जो ब्याज की जीन है कि विशेष रूप से विकास के चरण में लिखित है का प्रतिनिधित्व करता है. Fgf8a (Reifers एट अल, 1998;, चित्रा 2), deltaC (Oates एट अल, 2005) इस पाठ्यक्रम के प्रयोजनों के लिए, riboprobes aldh1a2 (; Begemann एट अल, 2001; चित्र 1 पहले raldh2) से संश्लेषित थे ; myod1 (Weinberg एट अल, 1996); shha (. Krauss एट अल, 1993), (ब्रांड एट अल, 1996, चित्रा 3) pax2a और myl7 (cmlc2 पहले, Yelon एट अल, 1999) सीडीएनए. धुंधला midline में और शारीरिक संरचनाओं सहित somites, tailbud, myotome, मस्तिष्क, और दिल में उम्मीद थी Ace/fgf8a म्यूटेंट में इन संरचनाओं के कई दोष है की उम्मीद थी. धुंधला आसानी से एक मानक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग visualized था. (; डी 'कोस्टा एट अल, 2009; Schmoldt एट अल, 2009, क्लार्क, 2003 Schoenwolf, 2009) अतिरिक्त स्रोतों यहाँ वर्णित उन लोगों के लिए इसी तरह की तकनीक इच्छा पर अधिक जानकारी और समस्या निवारण होते हैं.
चित्रा 1 zebrafish भ्रूण 24 घंटे पोस्ट निषेचन, जो aldh1a2 के लिए विशिष्ट riboprobes साथ संकरित किया गया है. विशिष्ट धुंधला आँखें, hindbrain, छाती पर का कवच पंख कली primordia, और somites में देखा जा सकता है है. पूर्वकाल शीर्ष पर है, पीछे नीचे है.
चित्रा 2. विकास के 13 somite स्तर पर एक zebrafish भ्रूण कि fgf8a के लिए एक जांच के विशिष्ट के साथ संकरित किया गया है. विशिष्ट धुंधला telencephalon, diencephalon पृष्ठीय, midbrain hindbrain सीमा, somites, और tailbud में देखा जाता है. बाईं ओर ventral है, पृष्ठीय सही करने के लिए है.
चित्रा 3. एक 22 घंटे के पोस्ट निषेचन zebrafish भ्रूण कि pax2a, एक मजबूत तंत्रिका तंत्र visualizing के लिए उपयोगी मार्कर के लिए एक riboprobe विशिष्ट के साथ संकरित किया गया है. विशिष्ट धुंधला रंजित विदर, midbrain hindbrain सीमा, कान पुटिका, और रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स में देखा जा सकता है. पृष्ठीय दृश्य के साथ छोड़ दिया करने के लिए पूर्वकाल.
Discussion
काश एक तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान प्रयोगशाला पाठ्यक्रम में इस्तेमाल किया गया था करने के लिए छात्रों को ज्ञात जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के दृश्य के माध्यम से शारीरिक विकास में आनुवंशिकी की भूमिका को समझने में मदद. पाठ्यक्रम के पहले भाग के लिए, छात्रों को कई अलग कोरडेट taxa का प्रतिनिधित्व जीवों पर dissections प्रदर्शन, उन्हें पर्याप्त समय का अध्ययन, समझने की, तुलना, और इसके विपरीत हड्डीवाला शरीर रचना विज्ञान दे.
पाठ्यक्रम के दूसरे भाग के लिए एक परिचय के रूप में, छात्रों को एक औपचारिक zebrafish विकास और शारीरिक रचना का वर्णन व्याख्यान दिए गए. तरीकों और इच्छा प्रयोग के अपेक्षित परिणाम भी विचार - विमर्श किया गया. छात्रों को तो somitogenesis और विकास के रस्मी-6 चरणों में थे रहते zebrafish दिया, और 2 और 5 दिनों के बाद निषेचन (DPF) पर विदारक माइक्रोस्कोप के तहत जांच करने के लिए. यह छात्रों zebrafish भ्रूण की तरह लग की एक बेहतर समझ और morphological परिवर्तन के प्रकार है कि ontogeny अधिक होने दे रहा था.
अगले प्रयोगशाला सत्र में छात्रों को zebrafish भ्रूण में जो इच्छा पहले किया गया था दिया गया. वे अध्ययन के लिए और ब्याज की प्रत्येक जीन (प्रयुक्त riboprobe) के लिए जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न का वर्णन करने के लिए पूछा गया. इच्छा के लिए इस्तेमाल किया भ्रूण एक विषमयुग्मजी ace/fgf8a लाइन के सदस्यों के बीच matings से प्राप्त किए गए . Mendelian वंशानुक्रम के आधार पर, ace/fgf8a matings से भ्रूण के 25% homozygous म्यूटेंट और संरचनात्मक इस पाठ्यक्रम में पर ध्यान केंद्रित संरचनाओं के कई दोष प्रदर्शन की उम्मीद थी . एलबर्टसन प्रयोगशाला में प्रकाशित रिपोर्ट और अप्रकाशित टिप्पणियों के आधार पर, मस्तिष्क और अनुचित दिल पाशन में दोष, somites में दोष (; एलबर्टसन और Yelick, 2005, व्यक्तिगत टिप्पणियों एट ब्रांड अल, 1996) के रूप में अच्छी तरह के रूप में की उम्मीद थी.
छात्रों को सभी नमूनों, जंगली प्रकार (विषमयुग्मजी जानवरों के विकास के प्रारंभिक चरणों में जंगली प्रकार भाई बहन से अप्रभेद्य हैं) और homozygous म्यूटेंट की जांच करने के लिए कहा गया प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न प्रस्तुत के लिए. वे तो उनके परिणाम का वर्णन करने के लिए प्रयोगशाला रिपोर्ट लिखने के लिए कहा गया, और शरीर रचना विज्ञान और आनुवंशिकी, कैसे दोषपूर्ण जीन की अभिव्यक्ति शारीरिक विरूपताओं उपजी हो सकता है की अपने ज्ञान के आधार पर.
छात्रों के लिए उत्साह और जिज्ञासा के साथ इस प्रयोगशाला व्यायाम प्राप्त करने के लिए लग रहा था. हाल इच्छा से पहले इस्तेमाल कभी नहीं किया था और पाठ्यक्रम के इस भाग में अत्यंत रुचि रखते थे. छात्र zebrafish पेचीदा भ्रूण में जीन अभिव्यक्ति की अलग पैटर्न मिला, कुछ भी वर्णित धुंधला पैटर्न उन्हें अच्छी तरह से ज्ञात डिजाइन और एक Smiley चेहरे के रूप में इस तरह के प्रतीकों, के साथ जोड़ द्वारा visualized. परिणामस्वरूप प्रयोगशाला की रिपोर्ट से पता चला छात्रों इच्छा प्रोटोकॉल और विशिष्ट शारीरिक संरचनाओं में जीन की अभिव्यक्ति के एक सामान्य समझ था. 2008b गीता - Loganathan एट अल, Huelsken एट अल, 2002; गीता - Loganathan एट अल, 2008a. छात्रों को भी जीन की विशिष्ट कार्यों को समझने के लिए आवश्यक थे प्रयोगशाला (Stickney एट अल, 2000 के दौरान करना चाहते हैं का उपयोग का अध्ययन ). यह स्पष्ट तथापि, कि कुछ छात्रों को संकेत दे रास्ते के सीमित पृष्ठभूमि ज्ञान और ब्याज की जीन था. में इन अवधारणाओं के बारे में अधिक जानकारी चाहते हैं कि परिचयात्मक व्याख्यान भविष्य तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान पाठ्यक्रमों में इच्छा का उपयोग करने के लिए एक स्वागत योग्य इसके अलावा हो सकता है.
के बाद से लगातार चार दिनों प्रोटोकॉल आम तौर पर लेता है, पाठ्यक्रम के समय पर निर्भर करता है, छात्रों को केवल वर्ग और प्रशिक्षक शेष के लिए जिम्मेदार होना चाहिए में प्रयोग का एक हिस्सा पूरा करने में सक्षम हो सकता है. हमारे तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान कक्षा में छात्रों को प्रयोगशाला में धुंधला प्रतिक्रियाओं पूरा किया, जबकि शिक्षण सहायक सभी पूर्ववर्ती कदम प्रदर्शन किया. यदि यह करने के लिए छात्रों के प्रदर्शन कक्षा में इच्छा है पसंद है, प्रोटोकॉल कि कई प्रयोगशाला सत्रों में किया जा सकता है, वर्ग की समय सीमा पर निर्भर करता है सब यूनिटों में विभाजित किया जा सकता है. यदि यह संभव के लिए छात्रों को पूरे प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए, क्योंकि यह यहाँ था प्रयोगशाला बैठक केवल एक बार एक सप्ताह के लिए कारण नहीं है, छात्रों के वर्ग की शुरुआत में धुंधला समाधान जोड़ सकते हैं और इस्तेमाल किया riboprobe के आधार पर कर सकते हैं, धुंधला पूरा एक घंटे के भीतर. समय यह दाग को विकसित करने के लिए लेता है प्रत्येक riboprobe और प्रयोगात्मक शर्तों की एक किस्म के साथ बहुत भिन्न होता है, और कक्षा से पहले पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, अगर छात्रों को केवल प्रयोगशाला में दाग से विकसित किया जाएगा, प्रशिक्षकों सभी पूर्ववर्ती कदम है, जो महत्वपूर्ण है और कक्षा के बाहर समय और प्रयास की आवश्यकता होगी के लिए जिम्मेदार हो जाएगा. अगर वांछित, एक छोटी इच्छा वैकल्पिक immunohistochemistry हो सकता है, एंटीबॉडी लेबल का उपयोग करने के लिए प्रोटीन स्थानीयकरण कल्पना कर सकता है, लेकिन इस समय, zebrafish विकासात्मक जीनों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी आसानी से उपलब्ध नहीं हैं. एक अन्य विकल्प विभिन्न हड्डीवाला प्रजातियों पर इच्छा का प्रदर्शन होगाएन डी है छात्रों को विभिन्न जीवों में एक ही जीनों की अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना (Pizard एट अल, 2004; Aramaki एट अल, 2007; उभरते मॉडल जीवों, 2008, 2010 उभरते मॉडल जीवों ).
का उपयोग करने का व्यापक लक्ष्य इच्छा एक तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान पाठ्यक्रम में छात्रों कैसे आणविक जैविक तकनीकों के लिए संरचनात्मक विकास का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है प्रदर्शित करने के लिए किया गया था. यह भी छात्रों के लिए एक अवसर के लिए कैसे बदल जीन अभिव्यक्ति न केवल विकास विरूपताओं भी लेकिन विकासवादी बदलने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में अटकलें प्रदान की है. विकासवादी विकास जीव विज्ञान (अक्सर के रूप में "evo देवो" निर्दिष्ट) के रूप में औपचारिक रूप दिया है, अध्ययन के इस तेजी से बढ़ते क्षेत्र के विकास के माध्यम से जीनोटाइप और phenotype के लिंक, और विकासवादी परिवर्तन के संभावित यंत्रवत अड्डों स्पष्ट करना है. इस क्षेत्र की वृद्धि के साथ, अधिक ecologists, organismal जीव, और physiologists अपने अनुसंधान में आणविक तकनीक काम कर रहे हैं. हम तर्क है कि एक तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान पाठ्यक्रम में इच्छा का उपयोग पाठ्यक्रम को बनाए रखने के अनुसंधान के क्षेत्र में वर्तमान तकनीकी और वैचारिक अग्रिमों के साथ दिनांक, और जैविक उपक्षेत्रों के संयोजन के द्वारा एक बेहतर ऊपरी स्तर जीव विज्ञान कोर्स का क्षैतिज संरेखण की सुविधा में मदद मिलेगी. इसके अलावा, इस एकीकृत दृष्टिकोण के छात्रों के एक पाठ्यक्रम में जैविक अनुसंधान तकनीकों का एक वर्गीकरण जानने का अवसर प्रदान होगा, एक और अधिक विविध शिक्षा और भविष्य अंतःविषय वैज्ञानिक अनुसंधान को बढ़ावा देने के लिए अग्रणी.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों सिरैक्यूज़ विश्वविद्यालय और डॉ. मर्लिन केर में तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान पाठ्यक्रम के प्रशासन में उनकी भूमिकाओं के लिए जीवविज्ञान विभाग को स्वीकार करना होगा. एलबर्टसन प्रयोगशाला अनुदान R21DE019223 द्वारा दंत चिकित्सा और craniofacial रिसर्च के स्वास्थ्य / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उम्र बढ़ने पर स्वास्थ्य / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान R01AG031922 से समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps) | Fisher Scientific | 2300000 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium | Invitrogen | C404003 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Isopropanol | Acros Organics | 42383-0010 | |
| Petri Dish 100 x 20 mm non treated | Laboratory Products Sales | 430591 | |
| 14 ml Culture Tube, Snap Top | Fisher Scientific | 1495911B | |
| Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA | New England Biolabs | varies | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml | Sigma-Aldrich | D5758-25mL | |
| Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g | Fisher Scientific | s608500 | |
| Gal 200 proof Ethyl alcohol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L | Fisher Scientific | bp13321 | |
| Agarose Low EEO 100 g | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Ethidium Bromide 10 ml | Sigma-Aldrich | 45-E1510 | |
| Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose | Fisher Scientific | BP655-1 | |
| 1 kb Full Scale DNA Ladder | Fisher Scientific | BP2582200 | |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Group | 11277073910 | |
| T3 RNA Polymerase | Roche Group | 1031163 | |
| T7 RNA Polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| SP6 RNA Polymerase | Roche Group | 810274 | |
| Protector Rnase Inhibitor | Roche Group | 3335399001 | |
| Dnase I, Rnase Free 10,000 units | Roche Group | 4716728001 | |
| EDTA molecular biology reagent | Sigma-Aldrich | e5134-500G | |
| Lithium Chloride 100 g | Fisher Scientific | L121100 | |
| Sodium Carbonate 1 kg | Fisher Scientific | BP357-1 | |
| Sodium Bicarbonate, 500 g | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Acetic Acid glacial ACS 500 ml | Fisher Scientific | a38500 | |
| Paraformaldehyde R 500 g | Fisher Scientific | o4042500 | |
| PBS Phosphate Buffer Saline 10X | Fisher Scientific | bp3991 | |
| Tween 20 500 ml | Fisher Scientific | bp337500 | |
| Methanol 5 L | Fisher Scientific | A4124 | |
| Proteinase K 50 mg | Fisher Scientific | bp170050 | |
| Formamide 1 L | Fisher Scientific | F841 | |
| 20x SSC 1 L | Fisher Scientific | bp13251 | |
| Citric Acid Anhydrous ACS 500 g | Fisher Scientific | a940500 | |
| Ribonucleic acid transfer type V | Sigma-Aldrich | r7876-2.5KU | |
| Heparin Sodium salt 50 mg | Fisher Scientific | bp252450 | |
| Maleic acid R 500 g | Fisher Scientific | o3417500 | |
| Sodium Chloride 500 g | Fisher Scientific | s271500 | |
| Sodium Hydroxide 500 g | Fisher Scientific | s318500 | |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| Lamb Serum 500 ml | Invitrogen | 16070096 | |
| Anti DIG AP fragments | Roche Group | 11093274910 | |
| 2M Tris Solution 500 ml | Fisher Scientific | bp1759500 | |
| Magnesium Chloride 500 g | Fisher Scientific | m33500 | |
| BCIP 3 ml | Roche Group | 11383221001 | |
| NBT 3 ml | Roche Group | 11383213001 | |
| Glycerol 99% 2.5 L | Fisher Scientific | AC158920025 | |
| Plate 12 well PS ST w/Lid | VWR international | 62406-165 | |
| Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262861 | |
| Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262890 | |
| 1.6 ml microfuge tube | Laboratory Products Sales | L234401 | |
| 2 Parafilm 2" x 250 ft | Fisher Scientific | s37441 | |
| Transfer Pipet 7 ml | USA Scientific, Inc. | 1020-2520 | |
| .1-10 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-3000 | |
| 1-200 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-0006 | |
| 101-1000 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-2021 | |
| Aluminum Foil | Grocery Store | ||
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References
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