Summary
Questo documento descrive una semplice tecnica per indurre alloantigen specifiche anergia nelle cellule mononucleari del sangue periferico. La tecnica può essere applicata clinicamente per generare non alloreactive cellule del donatore. L'infusione di queste cellule potrebbero migliorare la ricostituzione immunitario e ridurre la tossicità dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche.
Abstract
Trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (AHSCT) offre le migliori possibilità di cura per molti pazienti affetti da patologie ematologiche congenite ed acquisite. Purtroppo, il trapianto di cellule T del donatore alloreactive che riconoscono e danneggiare i tessuti sani del paziente può portare a Graft-versus-host disease (GvHD) 1. Una sfida per AHSCT di successo è la prevenzione della GvHD senza compromissione associati degli effetti benefici dei linfociti T del donatore, in particolare la ricostituzione immunitaria e prevenzione delle recidive. GvHD può essere evitato non specifici esaurimento delle cellule T del donatore da innesti di cellule staminali o da somministrazione di immunosoppressione farmacologica. Purtroppo questi approcci infezione e la malattia aumentano ricaduta 2-4. Una strategia alternativa è quella di esaurire alloreactive selettivamente le cellule T del donatore dopo allostimulation da cellule che presentano l'antigene destinatario (APC), prima del trapianto. Primi studi clinici di queste strategie allodepletion migliorato la ricostituzione immunitaria dopo trapianto HLA-non corrispondenti senza eccessi GvHD 5, 6. Tuttavia, alcune tecniche allodepletion richiedono specializzata destinatario produzione APC 6, 7 e alcuni approcci possono avere effetti off-target compreso l'esaurimento del donatore specifici dell'agente patogeno e le cellule T CD4 8 e cellule T regolatorie 9. Un approccio alternativo è l'inattivazione delle cellule T del donatore alloreactive attraverso l'induzione di specifici alloantigen iporesponsivi. Ciò si ottiene stimolando le cellule del donatore con il destinatario APC, fornendo blocco di CD28-mediata co-stimolazione dei segnali 10. Questo approccio "alloanergization" riduce alloreattività di 1-2 log preservando patogeni associati al tumore e le risposte delle cellule T antigene in vitro 11 . La strategia è stata impiegata con successo in 2 e 1 completato gli studi in corso clinico pilota in cui sono state infuse alloanergized linfociti T del donatore durante o dopo l'HLA-HSCT non corrispondenti con conseguente rapida ricostituzione immunitaria, infezioni pochi e meno gravi GvHD acuta e cronica di destinatari di controllo storico di non manipolata HLA-trapianto non corrispondenti 12. Qui si descrive la nostra attuale protocollo per la generazione di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) che sono stati alloanergized per HLA-non corrispondenti PBMC stimolatore indipendenti. Alloanergization si ottiene allostimulation in presenza di anticorpi monoclonali per i ligandi B7.1 e B7.1 di bloccare CD28-mediata costimolazione. Questa tecnica non richiede la produzione di stimolatore APC specializzate ed è semplice da eseguire, che richiedono solo un singolo e relativamente breve fase ex vivo di incubazione. Come tale, l'approccio può essere facilmente standardizzata per l'uso clinico di generare cellule T del donatore con alloreattività ridotta ma mantenendo specifici dell'agente patogeno e l'immunità per il trasferimento adottivo nel contesto di AHSCT per migliorare la ricostituzione immunitaria senza GvHD eccessivo.
Protocol
Discussion
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ficoll-Hypaque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Hepes 1M | Invitrogen | 15630-080 | |
L-Glutamine 200mM | Invitrogen | 25030-081 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
Human AB serum (heat inactivated) | Gemini Bio Products | 100-512 | Use validated batches |
Complete Culture Media (500ml) | 440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin | ||
Irradiator | GammaCell 1000 | ||
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps | Corning | 3056 | |
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies | See protocol text | ||
U bottomed 96 well culture plates | BD Biosciences | 353077 | |
Monoclonal CD3 antibody | Beckman Coulter Inc. | IM0178 | Reconstitute with 200ml distilled water |
Monoclonal CD28 antibody | Beckman Coulter Inc. | IM1376 | Reconstitute with 200ml distilled water |
CMV grade 2 antigen | Microbix | EL-01-02 | |
Tritiated Thymidine | NEN | NET027 | |
Scintillation Fluid | PerkinElmer, Inc. | 1205-440 | |
Harvester | Tomtec | ||
Printed Filtermat A | PerkinElmer, Inc. | 1450-421 | |
Filter Bag | PerkinElmer, Inc. | 1450-432 | |
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter | Wallac | ||
null |
References
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