In vitro assay van bacteriële hechting op zoogdieren epitheelcellen
Summary
Dit protocol is een eenvoudige bacteriële hechting test die bestaat in het tellen van de aantallen van bacteriële kolonievormende eenheden die in acht worden genomen op gekweekte cellen. De test is robuust, onafhankelijk van de adhesine bestudeerd en er zijn ontelbare variaties gebruikt in de meeste laboratoria werken aan bacteriële pathogenese.
Abstract
Te veroorzaken infecties, moeten bacteriën koloniseren hun gastheer. Bacteriële pathogenen uitdrukkelijke verschillende moleculen of structuren in staat om gehechtheid te bevorderen cellen 1 host. Deze adhesinen vertrouwen op interacties met de gastheercel receptoren aan de oppervlakte of oplosbare eiwitten fungeren als een brug tussen bacteriën en gastheer. Hechting is een belangrijke eerste stap voorafgaand aan de invasie en / of de secretie van toxines, het is dus een belangrijke gebeurtenis te worden bestudeerd in bacteriële pathogenese. Bovendien gehandeld bacteriën vaak prachtig veroorzaken verfijnd cellulaire reacties, de studies van die bevallen op het gebied van 2 'cellulaire microbiologie'. Robuuste analyses voor bacteriële hechting op gastheercellen en hun invasie daarom een belangrijke rol spelen in bacteriële pathogenese studies en zijn al lange tijd gebruikt in veel laboratoria pionier 3,4. Deze testen worden nu beoefend door de meeste laboratoria die werken op bacteriële pathogenese.
We beschrijven hier een standaard naleving test illustreert de bijdrage van een specifieke adhesine. We gebruiken de Escherichia coli stam 2787 5, een humaan pathogene stam de uiting van de autotransporter Adhesin Betrokken bij Diffuse Adherence (AIDA). Als een controle, gebruiken we een mutant stam ontbreekt de Aida-gen, 2787Δ Aida (F. Berthiaume en M. Mourez, niet gepubliceerd), en een commercieel laboratorium stam van E. coli, C600 (New England Biolabs). De bacteriën worden overgelaten aan zich te houden aan de cellen van de veelgebruikte HEp-2 menselijke epitheel cellijn. Deze test is minder uitgebreid beschreven voor 6.
Protocol
Discussion
Dit protocol beschrijft een standaard bacteriële hechting test die kan worden aangepast om invasie onderzoek (bijv. met gentamicine protectie-analyse, 3). Het tellen van het aantal kolonievormende eenheden kan kwantificering, in vergelijking met de aanpak vertrouwen op standaard visualisatie technieken onder een microscoop, zoals Giemsa kleuring. De laatste geeft slechts een kwalitatieve weergave van hechting, maar is vaak een nuttige aanvulling, omdat het kan differentiëren verschillende patronen van hecht…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werken in de laboratoria van de auteurs wordt ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada, de Canadese Institutes of Health Research, en de Canada Research Chairs programma. JL wordt ondersteund door een beurs van de Groupe d'Etude des proteïnen Membranaires (GEPROM) met middelen van het Fonds de Recherche en Sante du Quebec.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose DMEM | GIBCO-Invitrogen | 12430-054 |
| DDPBS | GIBCO-Invitrogen | 14190-144 |
| Bovine Growth Serum | Hyclone | SH3054 |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO-Invitrogen | 15140-148 |
| 24 well plates | Corning | 3337 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 |
Referências
- Kline, K. A. Bacterial adhesins in host-microbe interactions. Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. Cellular microbiology emerging. Science. 271, 315-315 (1996).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).
- Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Molecular Cellular Microbiology. , 161-161 (2002).
- Srivastava, A., Isberg, R. R., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Molecular Cellular Microbiology. , 179-179 (2002).
- Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
- Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
- Jacques, M., Paradis, S. E. Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae. FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).
- Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
- Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
- Nataro, J. P., Kaper, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).
- Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).
