질소 산화물과 세포로부터 전자 상자 성체의 프로그램 공명 분광학에 의한 초과 산화물 음이온 급진적가 탐지 스핀 트랩을 사용하여
Summary
전자 상자 성체의 공명 (EPR) 분광학은 철 (II)-N-메틸-D-glucamine dithiocarbamate, 철 (MGD)를 사용하여 인간 neutrophils에서 소 대동맥 내피 세포와 초과 산화물 라디칼 음이온에서 질소 산화물을 감지하기 위해 고용되었다<sub> 2</sub>와 5,5 – 디메틸-1-pyroroline-N-산화물 각각 DMPO.
Abstract
낮은 농도에서 반응 질소 / 산소 종 (ROS / RNS)은 신호 전달, 세포 기능 조절에 중요한 역할을하고, 면역 반응하지만, 관계가없는 농도에서 세포 생존 능력 1, 2에 해로운입니다. 살아있는 시스템이 ROS 생성을 조절하는 내생과식이 항산화 방어 메커니즘으로 발전했지만, ROS는 산소의 정상적인 신진 대사의 부산물 자연으로 연속적으로 생산되며 단백질 기능의 손실, DNA의 절단, 또는 지방질의 결과 biomolecules의 산화 손상을 일으킬 수 peroxidation 3, 궁극적으로 세포 부상 또는 사망 4로 이어지는 산화 스트레스합니다.
초과 산화물 라디칼 음이온 (O 2 • -)는 같은 peroxynitrite와 급진 히드록실과 같은 생물 학적 시스템에 존재하는 것으로 알려진 가장 높은 산화 종의 주요 전구체이다. O 2의 생성 • – 그러므로 산화 버스트의 첫 징후 신호를하고, 전TS 감지 및 / 또는 생물 학적 시스템의 격리가 중요합니다. 이 예제에서는 O 2 •이 – polymorphonuclear neutrophils (PMNs)에서 생성되었다. phorbol-12-myristate-13-아세테이트 (PMA)와 chemotactic 자극을 통해, PMN는 O 2 •를 생성 – 니코틴 아데닌 dinucleotide 인산 (NADPH) 옥시 데이스 5 활성화를 통해.
세 isoforms으로 제공 질소 산화물 (NO) synthase는 inducible -,의 연결 및 내피-NOS, 또는 iNOS, nNOS 나 eNOS는 각각 어떠한 6 생산도하는 NADPH를 이용하여 L-시트룰린로 L-아르기닌의 전환 catalyzes로 . 여기서는 내피 세포에서 아니오를 생성 않습니다. 산화 스트레스 조건 하에서, 예를 들어 eNOS는 O 2 •로 NO 생산으로 전환할 수 – 헴 7 또는 공동 인자, tetrahydrobiopterin (BH 4) 8 산화로 인한 것으로 생각됩니다 uncoupling라는 프로세스에.
오직 몇 가지가있다하지만 생물 학적 시스템의 자유 래디 칼의 검출을위한 안정적인 방법은 특이성과 감도에 의해 제한됩니다. 스핀 트래핑은 일반적으로 자유 래디 칼의 식별에 사용되며 전자 상자 성체의 공명 (EPR) 분광학에 의해 감지 수있는 영구적인 스핀 adduct를 형성 스핀 트랩에 대한 급진의 추가 반응을 포함하고 있습니다. 다양한 급진 부가물가 생성되는 래디 칼을 식별하고 급진적인 생산 9 자연과 속도론에 관한 풍부한 정보를 제공할 수 사용될 수 특유의 스펙트럼을 나타냅니다.
주기적 nitrones, 5,5 – 디메틸-pyrroline-N-옥사이드, DMPO 10 phosphoryl – 치환 DEPMPO 11 및 에스테르 – 치환, EMPO 12 BMPO 13, 널리 스핀 트랩으로 고용되어 – 후자의 스핀 adduct – 함정는 O 2 • 위해 더 이상 반 목숨을 전시. 철 (II)-N-메틸-D-glucamine dithiocarbamate, 철 (MGD) 2 </ 서브>는 일반적으로 adduct 형성과 스핀 adduct 14 높은 안정성의 높은 비율로 어떠한 인해를 잡을수 없다하는 데 사용됩니다.
Protocol
Discussion
EPR의 스핀 트래핑은 자유 래디 칼을 quantifying 및 식별을 위해 생명 의학 애플 리케이션의 광범위한 채용되었습니다. 스핀 트래핑은 고도로 민감한 NM에서 따라서 생물 학적 시스템의 응용에 적합하게 μm의에 이르기까지 다양한 농도로 래디 칼을 감지 할 수있다. 상자 성체의의 adduct, NO-철 2 +-MGD의 형성은 EPR 통해 NO 검출의 기초입니다. ~의 속도로 10 6 M -1 s의 -1에?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 국립 심장 폐 및 혈액 연구소 부여 RO1 HL81248에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
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