Rilevamento di ossido nitrico e anione superossido radicale da spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica da cellule con Spin Traps
Summary
La risonanza paramagnetica elettronica (EPR) spettroscopia è stato impiegato per rilevare ossido nitrico da cellule endoteliali aortiche bovine e radicale superossido da neutrofili umani utilizzando ferro (II)-N-metil-D-glucammina ditiocarbammato, Fe (MGD)<sub> 2</sub> E 5,5-dimetil-1-pyroroline-N-ossido, DMPO, rispettivamente.
Abstract
Azoto reattivo / specie di ossigeno (ROS / RNS) a basse concentrazioni gioca un ruolo importante nella regolazione della funzione delle cellule, di segnalazione, e la risposta immunitaria, ma in concentrazioni non regolamentati sono dannose per la vitalità cellulare 1, 2. Mentre i sistemi viventi si sono evoluti con meccanismi antiossidanti di difesa endogeni e dietetici per regolare ROS generazione, ROS vengono prodotti continuamente come naturali sottoprodotti del normale metabolismo di ossigeno e può causare danni ossidativi alle biomolecole con conseguente perdita di funzione della proteina, taglio del DNA, o lipidi perossidazione 3, e, infine, allo stress ossidativo che porta a lesioni o morte delle cellule 4.
Radicale superossido (O 2 • -) è il principale precursore di alcune delle specie più altamente ossidanti noti presenti in sistemi biologici, come perossinitrito e radicale idrossile. La generazione di O 2 • – segnala il primo segnale di burst ossidativo, e pertanto, its rilevamento e / o il sequestro nei sistemi biologici è importante. In questa dimostrazione, O 2 • – è stato generato da neutrofili polimorfonucleati (PMN). Attraverso la stimolazione chemiotattica con forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), PMN genera O 2 • – attraverso l'attivazione di nicotinammide adenin dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi 5.
Ossido nitrico (NO) sintasi che viene in tre isoforme, come inducibile-,-neuronale e endoteliale-NOS, o iNOS, eNOS nNOS o, rispettivamente, catalizza la conversione di L-arginina a L-citrullina, usando NADPH per produrre NO 6 . Qui, abbiamo generato NO da cellule endoteliali. In condizioni di stress ossidativo, eNOS ad esempio possibile passare dalla produzione di NO a O 2 • – in un processo chiamato disaccoppiamento, che è ritenuto essere causato da ossidazione di eme 7 o la co-fattore, tetraidrobiopterina (BH 4) 8.
Ci sono solo pochemetodi affidabili per la rilevazione di radicali liberi in sistemi biologici, ma sono limitati dalla specificità e sensibilità. Trapping Spin è comunemente utilizzato per l'identificazione di radicali liberi e comporta la reazione di addizione di un radicale di una trappola di spin formando un addotto persistente centrifuga che può essere rilevato dal risonanza paramagnetica elettronica (EPR) spettroscopia. Gli addotti vari radicali presentano spettro distintivo che può essere utilizzato per identificare i radicali che vengono generati e può fornire una grande quantità di informazioni sulla natura e la cinetica della produzione di radicali 9.
Le nitroni ciclici, 5,5-dimetil-pirrolina-N-ossido, DMPO 10, il fosforil-sostituito DEPMPO 11, e l'estere-sostituito, Empo BMPO 12 e 13, sono stati ampiamente impiegati come trappole di spin – spin quest'ultimo trappole esibendo emivita più lunga per O 2 • – addotto. Ferro (II)-N-metil-D-glucammina ditiocarbammato, Fe (MGD) 2 </> Sub è comunemente utilizzato per intercettare NO dovuto alla elevata di formazione di addotti e l'elevata stabilità dell'addotto rotazione 14.
Protocol
Discussion
Trapping centrifuga EPR è stato impiegato in una vasta gamma di applicazioni biomediche per quantificare e identificare i radicali liberi. Trapping Spin è altamente sensibile, in grado di rilevare radicali a concentrazioni comprese tra nM a pM rendendo così adatto per applicazioni in sistemi biologici. La formazione dell'addotto paramagnetico, NO-Fe 2 +-MGD, è la base di NO rilevamento via EPR. Fe 2 +-MGD reagisce rapidamente con NO 18 ad una velocità di ~ 10 6</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal National NIH Heart, Lung, and Blood Institute concessione RO1 HL81248.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
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