اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين
Summary
كان يعمل الإلكترون ممغطس صدى (EPR) التحليل الطيفي للكشف عن اكسيد النيتريك من الخلايا البطانية الأورطي البقري وأنيون دسموتاز الراديكالية من العدلات الإنسان باستخدام الحديد (II)-N-ميثيل-D-glucamine dithiocarbamate، الحديد (مليون جالون يوميا)<sub> 2</sub> و 5،5، ثنائي ميثيل-1-pyroroline-N-أكسيد، DMPO، على التوالي.
Abstract
النتروجين التفاعلي / أنواع الاكسجين (ريوس / RNS) بتركيزات منخفضة تلعب دورا هاما في تنظيم وظيفة الخلية، مما يشير، واستجابة جهاز المناعة ولكن في تركيزات غير المنظم تضر بقاء الخلية 1 و 2. في حين أن الأنظمة الحية تطورت مع الداخلية وآليات الدفاع المضادة للأكسدة الغذائية لتنظيم روس جيل، ويتم إنتاج ريوس مستمر وكأنها أمر طبيعي والمنتجات من عملية التمثيل الغذائي العادي للأوكسجين ويمكن أن يسبب الضرر التأكسدي للالجزيئات الحيوية مما يؤدي إلى فقدان وظيفة البروتين وانقسام الحمض النووي، أو دهن بيروكسيد 3، و في نهاية المطاف إلى الاكسدة مما أدى إلى إصابة أو موت الخلية 4.
أنيون دسموتاز الراديكالية (O 2 • -) هو مقدمة كبيرة لبعض من أكثر الأنواع المؤكسدة للغاية تعرف أنها موجودة في النظم البيولوجية مثل peroxynitrite والهيدروكسيل. جيل من O 2 • – يشير إلى أول بادرة من انفجار الأكسدة، وبالتالي، أناTS كشف و / أو عزل في النظم البيولوجية هو المهم. في هذه المظاهرة، O 2 • – قد ولدت من العدلات النوى (PMNs). من خلال تحفيز الكيميائي مع phorbol-12-myristate-خلات-13 (PMA)، PMN يولد O 2 • – عن طريق تفعيل أوكسيديز نيكوتيناميد ثنائي النوكليوتيد الأدينين (NADPH) فوسفات 5.
أكسيد النيتريك (NO) سينسيز والتي تأتي في ثلاثة الأشكال الإسوية، ومحرض، العصبية، وNOS البطانية، أو iNOS، nNOS أو أنوش، على التوالي، ويحفز على تحويل أرجينين-L إلى L-سيترولين، وذلك باستخدام لإنتاج NADPH رقم 6 . هنا، ولدت لدينا أي من الخلايا البطانية. في ظل ظروف الاكسدة، يمكن أنوش على سبيل المثال التحول من إنتاج NO إلى O 2 • – في عملية تسمى uncoupling، التي يعتقد أن سببها أكسدة الهيم (7) أو المشارك عامل، tetrahydrobiopterin (BH 4) 8.
هناك عدد قليل فقطوتقتصر وسائل موثوق بها للكشف عن الجذور الحرة في النظم البيولوجية ولكن عن طريق خصوصية وحساسية. ويشيع استخدام تعويض اللون تدور لتحديد الجذور الحرة وينطوي على رد فعل جذري إضافة إلى فخ تدور تشكيل معقد إضافي تدور الثابتة، ويمكن الكشف عنها بواسطة التحليل الطيفي الإلكترون ممغطس (EPR) صدى. وadducts مختلف جذري معرض طيف المميزة والتي يمكن استخدامها لتحديد الجذور التي يتم توليدها ويمكن أن توفر ثروة من المعلومات عن طبيعة وحركية الإنتاج جذري 9.
وقد تم في nitrones دوري، 5،5، ثنائي ميثيل-بيرولين-N-أكسيد، DMPO 10، DEPMPO فسفوريل-استبدال 11، واستر، بديلا، EMPO 12 و BMPO 13، استخدمت على نطاق واسع الشراك تدور – تدور الأخير الفخاخ واظهار أطول فترة منتصف العمر لO 2 • – معقد إضافي. الحديد (II)-N-ميثيل-D-glucamine dithiocarbamate، الحديد (مليون جالون يوميا) 2 </ يستخدم عادة> الباطن إلى اعتراض NO نظرا لارتفاع معدل تكوين معقد إضافي واستقرار عالية للناتج إضافة زيادة ونقصان 14.
Protocol
Discussion
واستخدمت EPR محاصرة تدور في مجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية لقياس وتحديد الجذور الحرة. محاصرة تدور حساس جدا، وقادرة على الكشف عن الجذور بتركيزات تتراوح بين نانومتر إلى ميكرومتر مما يجعلها مناسبة للتطبيق في النظم البيولوجية. تشكيل معقد إضافي متوازي المغنطيس?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة القومي للقلب والرئة والدم المعهد منحة RO1 HL81248.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
Referências
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- Clerch, L. B., Massaro, D. J. . Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. , (1997).
- Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths. Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).
- Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).
- Ignarro, L. J. . Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , (2009).
- Moreau, M. Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes. Bioquímica. 45, 3988-3999 (2006).
- Vasquez-Vivar, J. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping. Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects. Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).
- Frejaville, C. 5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).
- Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. 2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties. Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).
- Tsuchiya, K. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues. Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).
- RojasWahl, R. U. Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities. J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).
- Klempner, M. S., Gallin, J. I. Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations. Blood. 51, 659-669 (1978).
- Pou, S. Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies. Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones. J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).
- Britigan, B. E., Rosen, G. M. Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical. J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).
- Frejaville, C. 5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).
- Snyrychova, I. Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles. Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).
- Han, Y. Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies. J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).
- Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate. J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).
- Hardy, M. Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap. Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).
- Kim, S. -. U. Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies. J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).
