Summary
FRET-baserade journalister alltmer används för att övervaka kinas och fosfatas aktiviteter i levande celler. Här beskriver vi en metod på hur man använder FRET-baserade reportrar att bedöma cellcykeln-beroende förändringar i målet fosforylering.
Abstract
Förster resonans energy transfer (FRET)-baserade reportrar 1 medger en bedömning av endogena kinas och aktiviteter fosfatas i levande celler. Sådana givare består i regel av varianter av GFP och YFP ingrep genom en phosphorylatable sekvens och en fosfor-bindande domän. Vid fosforylering, sonden förändringar konformation, vilket resulterar i en förändring av avståndet eller orienteringen mellan fiskeripolitiken och YFP, vilket leder till en förändring i FRET effektivitet (Fig. 1). Flera givare har publicerats under det senaste decenniet, övervaka verksamheten balans av flera kinaser och fosfataser, däribland reportrar på PKA 2, 3 PKB, PKC 4, PKD 5, ERK 6, JNK 7, CDK 18, Aurora B 9 och Plk1 9 . Med tanke på den modulära design, fler sonder kommer sannolikt att dyka upp inom en snar framtid 10.
Progression genom cellcykeln påverkas av stress signaling vägar 11. Noterbart är cellcykeln regleras annorlunda under oberörd tillväxt jämfört med när celler återhämtar sig från stress 12. Time-lapse avbildning av celler genom cellcykeln kräver därför särskild försiktighet. Detta blir ett problem särskilt vid anställning ratiometrisk bildbehandling, eftersom två bilder med en hög signal-brus-förhållande som krävs för att korrekt tolka resultaten. Ratiometrisk FRET avbildning av beroende cellcykelns förändringar i kinas och fosfatas verksamheten huvudsakligen har begränsats till underavdelningar av cellcykeln 8,9,13,14.
Här diskuterar vi en metod för att övervaka FRET-baserade prober med ratiometrisk avbildning hela den mänskliga cellcykeln. Metoden bygger på utrustning som är tillgänglig för många forskare inom biovetenskap och inte kräver expertkunskaper om mikroskopi eller bildbehandling.
Protocol
1. Introduktion sonden till celler
- Co-transfektera celler med en FRET-baserad sond och en plasmid som ger resistens. Välj ett transfektion metod som är effektiv i din cell-typ av intresse. För U2OS celler standard kalciumfosfat transfektion metoder ger tillräckligt resultat 15.
- Markera celler i lämpliga antibiotika i minst sju dagar. Detta berikar mängd celler som uttrycker sonden och begränsar mängden celler med giftiga uttryck nivåer eller nivåer uttryck som allvarligt påverkar cellcykeln.
- (Valfritt) Välj för stabil kloner.
- Använda fast eller levande celler, kontrollera att både den gemensamma fiskeripolitiken och YFP finns i alla celler på ungefär samma förhållande.
- Vid vissa celler innehåller endast gemensamma fiskeripolitiken eller YFP har rekombination inträffat troligt. Rekombination kan ske antingen under bakterietillväxt eller efter transfektion av sonden och kan i det senare fallet beror på plasmiden kvalitet. Upprepa plasmid pgottgörelse och linjärisera plasmiden innan transfektion om problemet kvarstår.
2. Övervakning ratiometrisk FRET
- Seed celler på rätter glas botten, eller täckglas för montering i en kammare. Se till att disken / täckglas finns inga 1,5 (170 ìm tjock).
- Montera celler i tillväxt medium utan fenol rött på en motoriserad epifluorescensmikroskop med temperaturkontroll satt till 37 ° C. Se till att pH-reglering av media, antingen genom CO 2 eller med hjälp av CO 2-oberoende medier såsom Liebowitz-15.
- Fokus på celler med ljus. Titta inte på celler med fluorescerande ljus.
- Börja med att skaffa ett 12 eller 16 bitars bild med hjälp YFP excitation (YFPex) och YFP utsläpp (YFPem) filter och en lämplig dikroiskt spegel. Använd maximal binning tillgängliga som fortfarande tillåter krävs subcellulära upplösning. Med hjälp av en hög binning för att minska exponeringen tid eller intensitet är avgörande för att undvika fototoxicitet.
- MigAsure eller uppskatta bakgrunden intensiteten och den ungefärliga buller genom att mäta eller uppskatta den grova genomsnittliga, minsta och största pixelvärden i ett område saknar celler. Ändra exponeringstiden och neutrala filter densitet så att den genomsnittliga signalen i cellen är ungefär bakgrunden intensiteten plus fem till tio gånger skillnaden mellan max och min intensitet bakgrund.
- Kontrollera att bilderna inte är nära att bli mättad. Den maximala ljusstyrkan i bilden bör vara mindre än hälften av dynamiskt omfång (t.ex. maximalt 2000 i en 12 bitars bild) för att möjliggöra intensitet skillnader när celler in mitos.
- Upprepa steg från 2,4 till 2,6 med hjälp av GFP excitation och YFP filter utsläpp och en lämplig dikroiskt spegel.
- Markera flera regioner med transfekterade celler, med undantag för de regioner som används för punkt från 2,4 till 2,7, och se till att maximal intensitet är mindre än hälften av det dynamiska omfånget i alla celler.
- Starta en time-lapse experiment förvärvar två bilder var 45 min med YFPex - YFPem och CFPex - YFPem filter set.
3. Verifiera och optimera villkor
- Öppna förvärvade bilder och övervaka tiden cellcykeln från mitos till mitos för celler som uttrycker transfekterade sonden.
- Jämför den uppmätta tiden cellcykeln till publicerade data för den använda celltyp. Alternativt untransfected filmen celler genom att köpa en bild av genomlysning bara (t.ex. DIC eller faskontrast) varje timme för att få referens gånger cellcykeln.
- Vid tiden från mitos till mitos motsvarar referens timings cellcykeln vidare till steg 4. Alternativt kan åter få bilder med hjälp av hårdare exponering, mer tid-punkter eller flera z-nivåer och upprepar steg 3.
- Vid tiden från mitos till mitos inte motsvarar referens timings cellcykeln, transfekterade filmen celler genom att köpa en bild av genomlysning bara (t.ex. DIC eller faskontrast) varje timme följt av en bild i slutetav experiment för att identifiera transfekterade cellerna.
- Om transfekterade cellerna fortfarande visa längre cellcykeln gånger, upprepa steg 1, men transfektera mindre sond eller välja för stabila kloner som innehåller mycket små mängder av sonden.
- Om transfekterade celler uppvisar normala tider cellcykeln i frånvaro av fluorescerande ljus, upprepa steg 2 men lägre exponering genom att ändra binning, neutrala täthetsfilter, exponeringstid, och tiden mellan bilder.
4. Analysera FRET
- Analysen kan utföras av de flesta program tillägnat mikroskopi. Här beskriver vi hur du utför analysen med hjälp av gratisprogram ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij ) utnyttjar Plus plugin Ratio ( http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html ).
- Öppna bilderna i ImageJ. I de fall bilderna är i form av en flerfärgad STACk (t.ex. Deltavision), separat de enskilda kanalerna genom att först konvertera dem till ett HyperStack: Bild-HyperStack-stack till HyperStack och sedan dela upp dem på enstaka kanal staplar med: Image-HyperStack-minska dimensionerna
- Multiplicera YFPex - YFPem stack med 3 använder: Process-Math-Multiplicera Detta steg är frivilligt, eftersom det bara syftar till att öka den visuella tydligheten i bilder genom att säkerställa att kvoterna inte är i intervallet mellan 0 och 1.
- I YFPex - YFPem stack, dra en region av intresse (ROI) i ett område som saknar celler, men det är nära till en cell som ska mätas. Olika celler i samma bild kan kräva olika regioner, både som bakgrund och signalstyrka normalt är starkast i mitten av en bild.
- Lägg till ROI på ROI Manager: Analysera-tools-ROI manager.
- Mät den genomsnittliga intensiteten av ROI i både YFPex - YFPem och CFPex - YFPem stacken: Analysera-Mät
- Upprepa vid ett flertal tidpunkter och kontrollera att bakgrunden intensitet nära till cellen av intresse är likartade i hela filmen.
- Ställ mätningar för att inkludera minimal intensitet: Analysera-Set mätningar-Min och Max grått värde.
- Rita ett område av intresse som täcker större delen av en cell och mäta minimala intensitet i både YFPex - YFPem och CFPex - YFPem stacken. Ta skillnaden mellan det uppmätta minimal intensitet och bakgrunden intensiteten från 4,6 och dela det med två. Detta ger en utgångspunkt uppskattning för en klippning värde.
- Öppna Ratio Plus. Välj YFPex - YFPem och CFPex - YFPem stacken. För FRET proportionerna markerar du CFPex - YFPem som stack en, för inverterad FRET förhållandet visualisera sonder där FRET effektiviteten minskar när fosforylering, välj YFPex - YFPem som stack 1.
- Sätt in den uppmätta bakgrunden intensitet och värderingar klippning.
- Ställ skalning av den resulterande förhållandet stacken och applicera en lämplig look uP tabell (LUT) för att visualisera förhållandet förändringar.
5. Representativa resultat
Plk1 aktivitet är första synliga i kärnan i G2 fas och toppar under mitosen. Figur 3 visar ett experiment med minimal fototoxicitet inställningarna som beskrivs i avsnitt 2. Observera att detta är en representativ initiala resultat och att exponering villkor eller tiden mellan bilder kan modifieras för att öka signal-brus-förhållande eller tidsmässig. Figur 3D visar att en majoritet av de celler som uttrycker sonden förökar sig med en cell cykeltid på mellan 20 och 25 timmar, vilket indikerar att avbildning villkor och nivåer uttryck för sonden inte påverkar timings cellcykeln. Även om det finns betydande buller, utvecklingen av Plk1 aktiviteten ökar i G2 och en topp i mitos 14 syns tydligt (fig. 3A). Bearbetning av rådata, här genom att innebära filtrering presenteras som en kymograph (Fig. 3B) eller kvantifiering av den genomsnittliga inverterade RA Tio (fig. 3C) kan öka tydligheten.
Figur 1. Principen om en FRET-baserad sond för att övervaka kinas och fosfatas aktiviteter. Två fluoroforer, vanligtvis den gemensamma fiskeripolitiken (blå) och YFP (grön), är förbundna med en fosfor-bindande domän (orange) och en phosphorylatable sekvens (gul). Fosforylering (röd) medierar bindning till fosfor-bindande domänen, och därmed framkalla en conformationaländring i sonden. Den conformationaländring resulterar i en skillnad i avstånd eller orientering mellan de två fluoroforer, vilket påverkar FRET effektivitet mellan fiskeripolitiken och YFP. FRET kan visualiseras genom spännande gemensamma fiskeripolitiken och övervakning YFP utsläpp (streckade linjer).
Figur 2. Schematisk skiss av den experimentella proceduren.
p_upload/3410/3410fig3.jpg "/>
Figur 3. Plk1 aktivitet är första synliga i kärnan i G2 fas och toppar under mitosen. U2OS celler som uttrycker en FRET-baserad sond övervakning Plk1 aktiviteten 9,14 filmades under 60 tim med en Deltavision Spectris Imaging-system utrustat med en 20x NA 0,7 luft-objektiv och en kvicksilverlampa. Imaging förutsättningar valdes ut för att orsaka smärre fototoxicitet, som beskrivs i avsnitt 2, med hjälp av 4x binning och neutrala filter densitet som blockerar 99% av det inkommande ljuset. En, falska färgåtergivning av inverterad FRET-tal, efter en cell med 4 divisioner. B, kymograph i cellen visas i en efter att ha använt en genomsnittlig filter. C, kvantifiering av den inverterade FRET förhållandet cellen visas i A. D, kumulativ mitotiska inmatning av 50 FRET-probe uttrycka celler, inklusive divisioner dotterceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Övervakning FRET hela cellcykeln kräver överväganden som är mindre viktiga vid bedömningen av kortsiktiga reaktioner på yttre stimuli. För det första är cellcykelreglering lätt störd av stress signalering, som kräver att fototoxicitet hålls till ett minimum. För det andra kan alla reportrar påverka potentiellt cellulära processer genom att titrera ut kinaser, fosfataser eller domäner interaktion. Det förmodligen enklaste sättet att bedöma om de experimentella förutsättningarna är tillräckliga är att mäta längden cellcykeln från mitosen till mitos och jämföra det med experiment oberoende av fluorescens avbildning och uttryck av en sond.
En avgörande faktor i övervakningen FRET nyckeltal under hela cellcykeln är att motstå frestelsen att köpa vackra bilder med hög upplösning. Även om den exakta inställningarna beror på känsligheten i mikroskop systemet och uttryck nivån och arten av den särskilda sonden, är det viktigt att användaen nivå av binning som motsvarar vad som är absolut nödvändigt att se. Även tiden mellan CFPex - YFPem och YFPex - YFPem bilder måste vara kort för att undvika förändringar i cellernas morfologi, i våra händer är det bättre att hålla halterna gånger på mer än 0,1 sekunder och minska intensiteten i fluorescerande ljus med neutrala täthetsfilter .
Hur fototoxicitet påverkar cellcykeln beror till stor del på uttryck nivåer och lokalisering av sonden. En sond som är lokaliserad till kromatin, till exempel genom fusion med en Histon, gör cellerna mer känsliga för fluorescerande ljus, förmodligen eftersom fototoxisk biprodukter skapas i närheten av DNA. Det är därför viktigt att övervaka celler som uttrycker relativt låga nivåer av reportrar och att åter kontrollera cell-cykeln timings om lokalisera sonden till olika subcellulära strukturer.
Flera kontroll experiment behövs för att verifiera att FRET är närvarande iexperimentuppställning och att förändringar tal speglar det verkliga fosforyleringen av en sond. Förutom funktionella kontroller, t.ex. hämning eller utarmning av ett kinas, är det lämpligt att utföra biokemiska experiment för att kontrollera att sonden fosforyleras, mutation av den förväntade fosfor-acceptanten plats inom sonden till en icke-phosphorylatable rester, och acceptor fotoblekning till bevisa förekomsten av bandet. För ett exempel på en omfattande validering, se kompletterande figur 3 i ref 14.
Även om det teoretiskt att föredra att bedöma FRET förändringar genom att övervaka både gemensamma fiskeripolitiken och YFP utsläpp, är sådana uppställningar mycket känsliga för att fokusera förändringar och villkor belysning och kan lätt leda till artefakter. Känslighet för att fokusera förändringarna beror på kromatisk aberration, där den gemensamma fiskeripolitiken och YFP utsläpp inte fokuserar på samma punkt. Belysning förändringar beror till stor del på olika anpassning av ljusstrålen. Detta är särskilt framträdande när du använder filter kuber som innehålleren dikroisk spegel. Fokus och belysning förändring kan minskas med hjälp av korrigeras mål och omsorgsfullt anpassat filter kuber. Men i vår erfarenhet, att hålla konstanta utsläpp filtret ger överlägsna resultat, helst med hjälp av en installation med separat styrning av excitation och filter utsläpp.
Omfattningen av de observerade FRET-change är reducerad med bleedthrough från GFP fluorescens till YFP utsläpp filtret. Vid bleedthrough är betydande, en extra CFPex - CFPem bild kan förvärvas för att korrigera bleedthrough i CFPex - YFPem bild. Men sådana korrigeringar är mycket känsliga för att fokusera skillnader och får införa artefakter. Dessutom kräver de en extra bild, vilket kan ge fototoxicitet.
Även ett mindre problem när bara övervakning YFP utsläpp, hålla cellerna i fokus under en 24h + tidsförlopp experiment kan vara en utmaning. För att undvika fokus drivor, se till att mikroskopetoch skålen är förvärmda och att temperaturen i rummet det inte fluktuerar. Du kan också använda en autofokus system som inte bygger på avbildning av transfekterade sonden.
Valet av vilket mål som används beror på den aktuella applikationen. En oljebaserad hög NA mål samlar mer ljus och ger högre upplösning, men är mer känslig för att fokusera förändringar och är opraktiskt med hög halt inställningar. Vi föredrar att använda ett luft-mål med en relativt hög NA att studera cytoplasmisk eller kärnvapen FRET-tal och använda hög NA olja mål endast när högre subcellulära upplösning krävs.
Denna uppsats behandlar en enkel metod för att filma FRET-baserade prober genom cellcykeln som använder utrustning som är allmänt tillgängliga för många forskare inom life science och kräver endast en basal kunskap om mikroskopi och bildbehandling. Mer specialiserade alternativen hör av strålens-splitters, Fluorescens Lifetime Microscopy (Flim) 1 och programvara för att automatisera 16 objekt segmentering och beräkning av FRET ratio 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna stöds av det svenska Vetenskapsrådet, svenska Stiftelsen för strategisk forskning, svenska Cancerfonden, Svensk barncancer samhället, Åke Wibergs stiftelse och Jeanssons stiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15, no phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 21083-027 | |
| DMEM+Glutamax-I | GIBCO, by Life Technologies | 31966 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SV30160.03 | |
| 0.05% Trypsin EDTA | Hyclone | SH30236.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14287 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 |
References
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
- Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
- Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
- Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
- Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
- Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
- Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 Forthcoming.
- Morgan, D. O. The cell cycle : principles of control. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).
- Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
- Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
- van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).
