Het beoordelen van somatische hypermutatie in Ramos B-cellen na Overexpressie of Knockdown van specifieke genen
Summary
We beschrijven hoe retrovirale of lentivirale infecties van overexpressie of shRNA-bevattende constructies in het menselijk Ramos B-cellijn en hoe somatische hypermutatie te meten in deze cellen. Uit te voeren
Abstract
B-cellen beginnen hun leven met een lage affiniteit antilichamen gegenereerd door V (D) J recombinatie. Echter, bij het opsporen van een ziekteverwekker, is de variabele (V) regio van een immunoglobuline (Ig) gen ongeveer 100.000 keer meer dan de rest van het genoom door middel van somatische hypermutatie (SHM) gemuteerd, wat resulteert in een hoge affiniteit antilichamen 1,2. Daarnaast, klasse switch recombinatie (CSR) produceert antilichamen met verschillende effector functies, afhankelijk van de aard van de immuunrespons die nodig is voor een bepaalde ziekteverwekker. CSR en SHM worden geïnitieerd door de activatie-geïnduceerde cytidinedeaminase (AID), die cytosine residuen in DNA te produceren uracils deaminates. Deze uracils worden verwerkt door foutgevoelige vormen van reparatie wegen, uiteindelijk leidend tot mutaties en recombinatie 1-3.
Onze huidige kennis van de moleculaire details van de SHM en MVO komen uit een combinatie van studies in muizen, primaire cellen, cellijnen, en cel-free experimenten. Muismodellen blijft de gouden standaard met genetische knockouts tonen cruciale rol voor vele reparatie factoren (bijvoorbeeld Ung, MSH2, MSH6, Exo1, en polymerase η) 4-10. Echter, niet alle genen zijn vatbaar voor de knock-out studies. Bijvoorbeeld, knockouts van verschillende double-strand break repair eiwitten embryonaal dodelijk of aantasting B-cel ontwikkeling 11-14. Bovendien, soms de specifieke functie van een eiwit in SHM of MVO kan worden gemaskeerd door de meer globale defecten veroorzaakt door de knock-out. Daarnaast kan worden omdat experimenten in muizen langdurig, veranderen van de expressie van individuele genen in cellijnen is uitgegroeid tot een steeds populairder eerste stap naar het identificeren en karakteriseren kandidaat-genen 15-18.
Ramos – een Burkitt lymfoom cellijn die constitutief ondergaat SHM – is een populaire cellijn model om SHM 18-24 te bestuderen. Een voordeel van Ramos cellen is dat ze een ingebouwde handige semi hebben-Kwantitatieve meting van SHM. Wild-type cellen brengen IgM en, als ze pick-up mutaties, een aantal van de mutaties knock-out IgM expressie. Daarom is het testen van IgM verlies door fluorescentie-geactiveerde cel scanning (FACS) biedt een snelle uitlezing voor het niveau van de SHM. Een meer kwantitatieve meting van de SHM kan worden verkregen door direct sequencing het antilichaam genen.
Omdat Ramos-cellen zijn moeilijk te transfecteren, produceren we stabiele derivaten die zijn verhoogd of verlaagd expressie van een individueel gen door het infecteren van cellen met retrovirale of lentivirale constructen die ofwel een overexpressie cassette of een short hairpin RNA (shRNA), respectievelijk bevatten. Hier beschrijven we hoe we dan Ramos cellen te infecteren en het gebruik van deze cellen om de rol van specifieke genen op de SHM (figuur 1) te onderzoeken.
Protocol
Discussion
Zoals eerder besproken, hebben cellijn modellen voor antilichaam diversificatie uitgegroeid tot een populaire uitvalsbasis om nieuwe eiwitten die verschillende stappen invloed tijdens antilichaam diversificatie te identificeren. We presenteren hier een methode voor het gebruik van virale infectie van beide knock-down of overexpressie eiwitten in de Ramos B-cellijn en vervolgens onderzoekt de impact op de SHM.
Voor deze studies maken we gebruik van zowel WT Ramos en AID hi Ramos ce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De pMSCV-AID-I-Thy1.1 en pKat2 vectoren werden een soort geschenk van DG Schatz en de pVSV-G, pRSV-Rev, en pMDLg / pRRE vectoren werden een soort geschenk van BR Cullen.
Materials
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
Referências
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
