הערכת Hypermutation תאים סומטיים ב ראמוס B לאחר Overexpression או מציאה של גנים ספציפיים
Summary
אנו מתארים כיצד לבצע זיהומים retroviral או lentiviral של overexpression או shRNA המכילים בונה את קו האדם ראמוס תא B וכיצד למדוד hypermutation סומטיים בתאים אלה.
Abstract
בתאי B להתחיל את החיים שלהם עם נוגדנים זיקה נמוך שנוצר על ידי רקומבינציה V J (ד '). עם זאת, על גילוי פתוגן, (V) את המשתנה באזור של גן אימונוגלובולינים (איג) עובר מוטציה כ -100,000 פי יותר משאר הגנום באמצעות hypermutation סומטי (SHM), וכתוצאה מכך 1,2 זיקה נוגדנים גבוהה. בנוסף, מתג בכיתה רקומבינציה (CSR) מייצר נוגדנים עם מפעיל פונקציות שונות בהתאם לסוג התגובה החיסונית הדרוש פתוגן מסוים. שני CSR ו SHM הם שיזמו דאמינז ההפעלה הנגרמת cytidine (AID), אשר deaminates שאריות ציטוסין ב-DNA כדי לייצר uracils. Uracils אלה מטופלות על ידי צורות מועדת לטעויות של מסלולי תיקון, המוביל בסופו של דבר מוטציות רקומבינציה 1-3.
ההבנה הנוכחית שלנו את הפרטים המולקולריים של SHM ו CSR לבוא משילוב של מחקרים בעכברים, תאים ראשוניים, שורות תאים, ותא-fרי ניסויים. מודלים עכבר להישאר תקן הזהב עם knockouts הגנטי מראה תפקידים קריטיים עבור גורמים רבים לתקן (למשל אונג, Msh2, MSH6, Exo1 ו פולימראז η) 40-10. עם זאת, לא כל הגנים הנוחות ללימודי בנוקאאוט. לדוגמה, knockouts של כמה גדיל פעמיים חלבונים לתקן לשבור הם קטלניים embryonically או לפגום B-cell פיתוח 11-14. יתר על כן, לפעמים הפונקציה ספציפי של חלבון ב SHM או אחריות חברתית עשויה להיות רעולי פנים על ידי פגמים הגלובלי הנגרם על ידי יותר בנוקאאוט. בנוסף, מאז ניסויים בעכברים יכול להיות ארוך, לשנות את הביטוי של גנים בודדים שורות תאים הפך יותר ויותר פופולרי הצעד הראשון לזיהוי ואפיון גנים מועמדים 15-18.
ראמוס – תא לימפומה Burkitt קו constitutively עובר SHM – כבר מודל פופולרי תא שורת ללמוד SHM 18-24. אחד היתרונות של תאים ראמוס הוא שיש להם מובנית למחצה נוחמדד כמותי-SHM. תאים מסוג Wild להביע IgM, וכפי שהם להרים מוטציות, כמה מוטציות לדפוק את הביטוי IgM. לכן, assaying הפסד IgM ידי סריקת הקרינה המופעל תאים (FACS) מספק מהיר לקריאה החוצה ברמה של SHM. מדידה כמותית של SHM יותר ניתן להשיג על ידי ישירות רצף הגנים נוגדנים.
מכיוון שתאי ראמוס קשה transfect, אנחנו מייצרים נגזרים יציב הגדילו או הוריד הביטוי של גן יחיד על ידי הדבקה של תאים עם בונה retroviral או lentiviral המכילות קלטת overexpression או סיכת ראש רנ"א קצרות (shRNA), בהתאמה. כאן, אנו מתארים כיצד אנו להדביק תאים ראמוס ולאחר מכן להשתמש בתאים אלה כדי לחקור את תפקידה של גנים ספציפיים על SHM (איור 1).
Protocol
Discussion
כפי שנאמר קודם לכן, שורת תאים מודלים גיוון נוגדן הפכו נקודת המוצא הפופולרית לזהות חלבונים חדשים המשפיעים על שלבים שונים במהלך פיזור נוגדנים. אנו מציגים כאן שיטה באמצעות זיהום ויראלי חלבונים או לדפוק למטה או overexpress בקו ראמוס B-cell ולאחר מכן לבחון את ההשפעה על SHM.
<p class="…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PMSCV-AID-I-Thy1.1 ו pKat2 וקטורים היו מתנה סוג של DG שץ לבין pVSV-G, pRSV-Rev ו pMDLg / pRRE וקטורים היו מתנה סוג של BR קאלן.
Materials
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
Referências
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
