Valutare mutazione somatica nel Ramos cellule B dopo iperespressione o Knockdown di specifici geni
Summary
Ci descrivono come eseguire infezioni retrovirali o lentivirali di sovraespressione o shRNA contenenti costruisce nell'essere umano a cellule B Ramos line e come misurare mutazione somatica in queste cellule.
Abstract
Le cellule B iniziano la loro vita con gli anticorpi a bassa affinità generato da V (D) J ricombinazione. Tuttavia, al rilevamento un agente patogeno, la (V) regione variabile di un gene immunoglobuline (Ig) è mutato circa 100.000 volte più del resto del genoma attraverso la mutazione somatica (SHM), con conseguente 1,2 anticorpi ad alta affinità. Inoltre, passare ricombinazione di classe (CSR) produce anticorpi con differenti funzioni effettrici a seconda del tipo di risposta immunitaria che è necessario per un particolare agente patogeno. Sia CSR e SHM vengono avviate attraverso l'attivazione indotta citidina deaminasi (AID), che deamina residui di citosina nel DNA per produrre uracils. Queste uracils sono trattati con forme soggette a errori di percorsi di riparazione, alla fine portano a mutazioni e la ricombinazione 1-3.
La nostra attuale comprensione dei dettagli molecolari di SHM e RSI provenire da una combinazione di studi in topi, pile, di linee cellulari e cellule-free esperimenti. Modelli murini rimangono il gold standard con fori genetica che mostrano ruoli critici per la riparazione di molti fattori (ad esempio Ung, MSH2, MSH6, Exo1 e polimerasi η) 4-10. Tuttavia, non tutti i geni sono suscettibili per gli studi di eliminazione diretta. Per esempio, KO di proteine diverse rottura a doppio filamento di riparazione sono embrionalmente letali o mettere in pericolo lo sviluppo delle cellule B 11-14. Inoltre, a volte la funzione specifica di una proteina in SHM o CSR può essere mascherato da più difetti globale causato dalla eliminazione diretta. Inoltre, dal momento che gli esperimenti sui topi possono essere lunghe, alterando l'espressione di singoli geni in linee cellulari è diventata una tappa sempre più popolare primi a identificare e caratterizzare geni candidati 15-18.
Ramos – una linea cellulare di linfoma di Burkitt che subisce costitutivamente SHM – è stata una popolare linea cellulare modello per studiare SHM 18-24. Un vantaggio di cellule Ramos è che hanno un built-in semi conveniente-Quantitativa misura di SHM. Cellule wild-type esprimere IgM e, come raccogliere le mutazioni, alcune delle mutazioni knock out espressione IgM. Pertanto, il saggio perdita IgM di fluorescenza attivata la scansione cellulare (FACS) fornisce una rapida lettura per il livello di SHM. Una misura più quantitativa di SHM possono essere ottenute direttamente sequenziamento dei geni anticorpali.
Dato che le cellule Ramos è difficile trasfezione, produciamo derivati stabili che hanno aumentato o diminuito l'espressione di un singolo gene da infettare le cellule con costrutti retrovirali o lentivirali che contengono una cassetta iperespressione o un breve hairpin RNA (shRNA), rispettivamente. Qui, descriviamo il modo in cui infettare le cellule Ramos e quindi utilizzare queste cellule per studiare il ruolo di specifici geni in SHM (Figura 1).
Protocol
Discussion
Come discusso precedentemente, i modelli di linee cellulari per la diversificazione degli anticorpi sono diventati un punto di partenza per identificare nuove proteine che influenzano le diverse fasi durante la diversificazione degli anticorpi. Vi presentiamo qui un metodo per l'utilizzo di infezione virale alle proteine o knock-down o iperespressione in cellule B Ramos linea e quindi esaminare l'impatto sulla SHM.
Per questi studi, ci avvaliamo sia Ramos WT e AID hi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il pMSCV-AID-I-Thy1.1 e pKat2 vettori erano un gentile dono della DG Schatz e pVSV-G, pRSV-Rev, e pMDLg / pRRE vettori erano un gentile dono da BR Cullen.
Materials
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
Referências
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