特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスB細胞に体細胞高頻度変異の評価
Summary
我々は、過剰発現またはshRNAを含む人間ラモスB細胞株とどのようにこれらの細胞で体細胞高頻度変異を測定するためのコンストラクトのレトロウイルスやレンチウイルス感染症を実行する方法について説明します。
Abstract
B細胞は、V（D）J組換えにより生成された低親和性の抗体とその生活を始める。しかし、病原体を検出すると、免疫グロブリン（Ig）遺伝子の可変（V）領域は、高親和性抗体の1,2の結果、約10万倍以上の体細胞超変異（SHM）を通じて、ゲノムの他の部分よりも変異している。さらに、クラススイッチ組み換え（CSR）は、特定の病原体に必要とされる免疫応答の種類に応じて、異なるエフェクター機能を有する抗体を産生する。 CSRとSHMの両方は、ウラシルを生成するためにDNAのシトシン残基をdeaminates活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AID）によって開始されています。これらのウラシルは、最終的には突然変異と1-3組換えにつながる、修復経路のエラーが発生しやすいフォームによって処理されます。
マウスでの研究の組み合わせから来るSHMとCSRの分子の詳細、主要な細胞、細胞株、およびセルの- fの私たちの現在の理解REE実験。マウスモデルは、多くの修復因子（例えば雄、MSH2、MSH6、EXO1、およびポリメラーゼη）4-10のために重要な役割を示す遺伝子ノックアウトとゴールドスタンダードのまま。ただし、すべての遺伝子がノックアウトの研究のために適している。例えば、いくつかの二重鎖切断修復タンパク質のノックアウトはembryonically致死的またはB細胞の開発11-14損なう。また、時々SHMやCSRにおけるタンパク質の特定の機能をノックアウトによって引き起こされる多くの世界的な欠陥によってマスクされることがあります。さらに、マウスでの実験以来、細胞株における個々の遺伝子の発現が候補遺伝子15-18識別し、特徴付けるために、ますます人気の第一歩となっている変更、時間がかかる場合があります。
ラモス-構成的にSHMを受けるバーキットリンパ腫細胞株は- SHM 18-24勉強に人気の細胞ラインのモデルとなっています。ラモス細胞の一つの利点は、内蔵の便利なセミを持っていることです。SHMの定量的尺度。野生型の細胞は、突然変異、IgM抗体の発現をノックアウト変異のいくつかをピックアップとして、IgMを発現しており。したがって、蛍光活性化細胞のスキャン（FACS）によってIgMの損失をアッセイすることSHMのレベルのための読み出し迅速に提供します。 SHMのより定量的な測定は、直接抗体遺伝子をシーケンシングすることによって得ることができる。
ラモス細胞はトランスフェクションが困難なので、我々はそれぞれ過剰発現カセットまたは短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、のいずれかを含むレトロウイルスやレンチウイルスのコンストラクトで細胞を感染させることによって増加または個々の遺伝子の発現を低下している安定した誘導体を生成する。ここで、我々はラモスの細胞に感染してから、SHM（図1）上の特定の遺伝子の役割を調べるために、これらの細胞を使用する方法について説明します。
Protocol
1。準備サンプルと細胞過剰発現のDNAの中規模の準備（ミディプレップ）またはshRNAを含むコンストラクトとレトロウイルスパッケージングベクトルpKat2またはレンチウイルスのパッケージングベクターをpVSV – G、pMDLg / pRRE、およびpRSV -リビジョン25を実行します。各構築物とpKat24μgの（レトロウイルス感染症の場合）またはpVSV – G、pMDLg / pRRE、およびpRSV – REVのパッケージングベ…
Discussion
前述したように、抗体の多様化のための細胞株のモデルは、抗体の多様化中に別のステップに影響を与える新規タンパク質を同定するために人気の出発点となっている。我々はここにラモスB細胞株におけるノックダウンまたは過剰発現するタンパク質のいずれかにウイルス感染を使用するための方法を提示し、SHMの影響を調べる。
これらの研究では、WTラモスとAID ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pMSCV – AID – I – Thy1.1とpKat2ベクトルはDGシャッツから親切な贈り物だったとpVSV – G、pRSV – REV、およびpMDLg / pRREベクトルはBRカレンから親切な贈り物でした。
Materials
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
Referências
- Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).
- Peled, J. U. The biochemistry of somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).
- Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. AID in somatic hypermutation and class switch recombination. Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).
- Bardwell, P. D. Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice. Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).
- Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination. J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).
- Phung, Q. H. Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein. J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).
- Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting. Immunity. 9, 135-141 (1998).
- Rada, C. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).
- Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).
- Masuda, K. DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation. Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).
- Lim, D. S., Hasty, P. A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).
- Xiao, Y., Weaver, D. T. Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).
- Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice. Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).
- Luo, G. Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).
- Pavri, R. Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5. Cell. 143, 122-133 (2010).
- Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).
- Basu, U. The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates. Cell. 144, 353-363 (2011).
- Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions. Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).
- Sale, J. E., Neuberger, M. S. TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity. 9, 859-869 (1998).
- Cumbers, S. J. Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).
- Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes. Nature. 408, 216-221 (2000).
- Parsa, J. Y. AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position. Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).
- Zhang, W. Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).
- Ukai, A. Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location. J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Nakamura, M. High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells. Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).
- Muramatsu, M. Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).
Tags
Somatic HypermutationRamos B CellsOverexpressionKnockdownSpecific GenesV(D)J RecombinationAffinity AntibodiesImmunoglobulin GeneSomatic Hypermutation (SHM)Class Switch Recombination (CSR)Activation-induced Cytidine Deaminase (AID)Cytosine ResiduesUracilsRepair PathwaysMolecular DetailsMice ModelsGenetic KnockoutsRepair FactorsDouble-strand Break Repair ProteinsB-cell Development
Citar este artigo
Upton, D. C., Unniraman, S. Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes. J. Vis. Exp. (57), e3573, doi:10.3791/3573 (2011).