특정 유전자의 Overexpression 또는 최저 후 라모스의 B 세포에서 체세포 Hypermutation을 평가
Summary
우리는 overexpression 또는 shRNA 함유 인간 라모스 B – 세포주에서 어떻게 이러한 세포에 체세포 hypermutation를 측정하는 구성합니다.의 retroviral 또는 lentiviral 감염을 수행하는 방법을 설명합니다
Abstract
B 세포는 V (D) J 재조합에 의해 생성된 낮은 친화 항체와 그들의 인생을 시작합니다. 그러나 병원체를 감지시, 면역 글로불린 (IG) 유전자의 변수 (V) 지역은 높은 친화 항체 1,2의 결과로, 약 100,000 배 더 체세포 hypermutation (SHM)을 통해 게놈의 나머지 부분보다 변이이다. 또한, 클래스 스위치 재조합 (CSR)은 특정 병원체에 대한 필요한 면역 반응의 종류에 따라 다른 이펙터 기능을 가진 항체를 생산하고 있습니다. CSR과 SHM 모두 uracils 생산 DNA의 사이 토신 잔류물을 deaminates 활성화 유발 cytidine의 deaminase (AID)에 의해 시작됩니다. 이러한 uracils 결국 돌연변이와 재조합 1-3 이어지는, 복구 경로의 오류가 발생하기 쉬운 형태로 처리됩니다.
SHM와 CSR의 분자 자세한 내용은 우리의 현재 이해가 생쥐의 연구 조합에서 온, 기본 셀, 셀 라인, 세포 – F합 실험. 마우스 모델은 많은 수리 요인 (예 : 엉, Msh2, Msh6, Exo1, 그리고 효소 η) 40-10 위해 중요한 역할을 보여주는 유전자 knockouts있는 황금 표준 남아 있습니다. 그러나, 모든 유전자 녹아웃 연구에 대한 의무가 있습니다. 예를 들어, 여러 번 스트랜드 브레이크 수리 단백질의 knockouts는 embryonically 치명거나 B – 세포 개발에 11-14을 손상. 또한, 때로는 SHM 또는 CSR에서 단백질의 특정 기능은 녹아웃으로 인한 더 많은 글로벌 결함에 의해 마스크 수 있습니다. 또한, 마우스의 실험 이후 셀 라인에서 개별 유전자의 표현이 후보 유전자 15-18을 식별하고 특성화하기 위해 점점 더 인기를 첫 번째 단계가되었습니다 변경, 긴 수 있습니다.
라모스는 – constitutively SHM를 겪습 Burkitt의 림프종 세포 라인 – SHM 18-24 공부를하기 위해 인기있는 세포 라인 모델을하고 있습니다. 라모스 세포 중 하나 장점은 그들이 내장된 편리한 준결승있다는 것입니다SHM의 – 양적 측정합니다. 야생 타입 세포들은 돌연변이, IgM 표현을 때려 눕힌 변이의 일부를 데리러으로 IgM을 표현합니다. 따라서, 형광 – 활성 세포 검사 (FACS)의 IgM 손실을 시금 것은 SHM의 수준에 대한 읽기 밖으로 빠르게 제공합니다. SHM보다 양적 측정은 직접 항체 유전자를 시퀀싱하여 얻을 수 있습니다.
라모스의 세포가 transfect하기가 어렵습니다 때문에, 우리는 각각 overexpression 카세트 또는 짧은 머리 핀의 자형으로 RNA (shRNA) 중 하나를 포함하는 retroviral 또는 lentiviral 구조와 세포를 감염 증가 또는 개별 유전자의 표현을 떠난 이후 안정적인 파생 상품을 생산합니다. 여기, 우리가 라모스 세포를 감염 후 SHM에서 특정 유전자 (그림 1)의 역할을 조사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.
Protocol
Discussion
마찬가지로 이전에 논의, 항체 다양성을위한 세포주 모델 항체 다변화하는 동안 여러 단계에 영향을 소설 단백질을 식별하는 인기있는 출발점이되고 있습니다. 우리는 여기서 라모스 B – 세포 라인에 노크 다운 또는 overexpress 중 단백질로 바이러스 감염을 사용하는 방법을 제시하고 SHM에 미치는 영향을 검사합니다.
이러한 연구에 대한, 우리는 WT 라모스와 AID 안녕 라…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pMSCV – AID – I – Thy1.1과 pKat2 벡터는 DG Schatz와 pVSV – G, pRSV – 레브의 종류 선물했고, pMDLg / pRRE 벡터는 BR 컬른에서 어떤 선물했다.
Materials
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
Referências
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