أ ف التوحد لجنة المساواة العرقية ، السلمون المدخن النهج للكشف عن خلية الانصهار في فيفو</em
Summary
ووصف طريقة لتعقب الخلية الانصهار في الكائنات الحية على مر الزمن. ويستخدم نهج لجنة المساواة العرقية.<em> LoxP</em> التوحد للحث على التعبير luciferase الانصهار الخلية. ويمكن الكشف عن إشارة الانارة ولدت في الكائنات الحية باستخدام نظم التصوير biophotonic مع حساسية الكشف عن الخلايا 1000 ~ في الأنسجة الطرفية.
Abstract
وقد استخدمت هذه القدرة من اثنين أو أكثر من الخلايا من نفس النوع على المزج بين التطور في جميع أنحاء metazoans لتشكيل أجهزة معقدة كثيرة ، بما في ذلك الهيكل العظمي والعضلات والعظام والمشيمة. الدراسات المعاصرة تثبت انصهار خلايا من نفس النوع تمنح وظيفة المحسنة. على سبيل المثال ، عندما خلايا الأرومة الغاذية من الصمامات المشيمة لتشكيل الأرومة الغاذية المخلوية ، والأرومة الغاذية المخلوية أقدر على نقل المواد الغذائية والهرمونات عبر حاجز الأم والجنين من غير مدمجة trophoblasts 1-4. المزيد من الدراسات الحديثة تظهر مزيجا من أنواع مختلفة من الخلايا يمكن أن يوجه مصير الخلية. وكان يعتقد مرة واحدة "الارتداد" أو تعديل مصير الخلية التي الانصهار إلى أن تقتصر على أنظمة الثقافة الخلية. بل أدى ظهور زرع الخلايا الجذعية لاكتشاف من قبلنا وغيرها من الجهات التي يمكن أن الخلايا الجذعية تندمج مع الخلايا الجسدية في الجسم الحي والتي تسهل الاندماج تمايز الخلايا الجذعية 5-7. وهكذا ، والانصهار الخلية هو تنظيم عملية جيمكن apable تعزيز بقاء الخلايا والتمايز ، وبالتالي يكون من الأهمية المركزية لإصلاح وتطوير الأنسجة وحتى التسبب في المرض.
الحد من الانصهار دراسة الخلية ، هو الافتقار إلى التكنولوجيا المناسبة ل1) تحديد المنتجات بدقة والانصهار 2) تتبع المنتجات الانصهار مع مرور الوقت. هنا نقدم منهجا جديدا لمعالجة كل القيود عن طريق تحريض تلألؤ بيولوجي على الانصهار (الشكل 1) ؛ ويمكن الكشف عن تلألؤ بيولوجي مع حساسية عالية في الجسم الحي 15/08 ونحن الاستفادة من بناء ترميز luciferase يراعة (Photinus البرالس) وضعت بالقرب من الجين a كودون وقف يحيط بها سلاسل LoxP عند التعبير عن هذه الخلايا بخلايا فتيل الجين التعبير عن بروتين recombinase لجنة المساواة العرقية ، والمشقوق المواقع LoxP ورفعه إشارة تكف عن السماح النسخ من luciferase. لأن الإشارة induciبلي ، من حدوث إشارات إيجابية كاذبة منخفض جدا. على عكس الطرق الحالية التي تستخدم نظام لجنة المساواة العرقية / LoxP 16 ، 17 ، أدخلنا إشارة "حية" الكشف وبالتالي تحمل للمرة الأولى الفرصة لتتبع حركية الانصهار خلية في الجسم الحي.
للتدليل على النهج ، معربا عن الفئران بتواجد مطلق لجنة المساواة العرقية recombinase بمثابة المستفيدين من الخلايا الجذعية transfected مع بناء للتعبير عن المصب luciferase من كودون وقف floxed. تم زرع الخلايا الجذعية عن طريق الحقن intramyocardial وبعد إجراء زرع تحليل الصور intravital لتتبع وجود المنتجات الانصهار في القلب والأنسجة المحيطة بها على مر الزمن. ويمكن تكييف هذا النهج لتحليل خلايا الانصهار في أي نوع النسيج في أي مرحلة من مراحل المرض ، وتطوير أو إصلاح الأنسجة الكبار.
Protocol
Discussion
وصف الأسلوب هنا يسمح ، للمرة الأولى ، وتحديد وتحليل منفصلة الزماني للانصهار الخلية في الكائنات الحية ، بما في ذلك الحيوانات الصغيرة. نهج يجمع بين لجنة المساواة العرقية ، مع إعادة التركيب LoxP اللاحقة biophotonic تحليل الصور. هذا النهج هو قابلة للتتبع ليس فقط الخلايا خلايا ا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور بيمان Hemmati (قسم الطب في جامعة ويسكونسن ماديسون) لتوفير بسخاء H1 اللجان الدائمة ، والدكتور تيم هاكر ، والدكتور سونغ Gouqing والسيدة جيل كوخ من جامعة ويسكونسن فسيولوجيا القلب والأوعية الدموية مرفق الأساسية لأداء جراحات الماوس. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية من خلال زمالة بحوث الدراسات العليا لفريمان بريان والمعاهد الوطنية للصحة HL089679 R21.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
Referências
- Bernirschke, K. K. P. . Pathology of the Human Placenta. , (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
- Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy–its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
- Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
- Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
- Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
- Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
- Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
- Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
- Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
- Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O’Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
- Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
- Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
- Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
- Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
- Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
- Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
