細胞融合の検出のためのCre - LOX Pの組換えのアプローチインビボでの</em
Summary
時間の経過とともに生物の細胞融合を追跡する方法について説明する。アプローチは、Creを利用し<em>つのloxP</em>再結合は、細胞融合によりルシフェラーゼ発現を誘導する。生成された発光シグナルは、末梢組織で〜1,000細胞の検出の感度バイオフォトニックイメージングシステムを用いて生体内で検出することができます。
Abstract
融合し、同じタイプの2つ以上のセルの能力は、骨格筋、骨、胎盤を含む多くの複雑な器官を形成し、進化の過程で後生動物に利用されている。現代の研究では、同じタイプの拡張機能を与えるの細胞の融合を示しています。例えば、胎盤のヒューズの栄養膜細胞が合胞体栄養細胞を形成する際に、合胞体栄養細胞はより未融合のトロホブラスト1月4日より母体胎児関門の栄養素やホルモンを輸送することができます。より最近の研究では、異なる種類の細胞の融合は、細胞の運命を導くことを実証。融合による"復帰"または細胞の運命の変更は、いったん細胞培養系に限定されると考えられていた。しかし、幹細胞移植の出現は、私たちが発見につながったと幹細胞を他の人は、in vivoでの体細胞と融合することができ、その融合は、幹細胞の分化5-7を容易にします。従って、細胞融合は、規制プロセスのcですしたがって、細胞の生存と分化を促進するのapableとさらに発展、組織の修復と疾患の病因の中心的な重要性の可能性があります。
適切な技術の不足が）1に、細胞融合の研究をされている制限することで、正確に時間をかけて）、トラックの融合製品を融合製品を識別し、2。ここでは、融合時に生物発光の誘導（ 図1）を経由して、両方の制限に対処するために新しいアプローチを提示する、生物発光は 、in vivo 8-15 の高感度で検出することができます私たちは、ホタルルシフェラーゼ（Photinusスピラリス ）遺伝子は隣接して配置符号化構造を利用する 。 loxP配列で挟まれた。細胞は、Creリコンビナーゼの蛋白質を発現する細胞でこの遺伝子のヒューズを表現するときは、 つのloxP部位が切断されると停止信号がルシフェラーゼの転写を可能に切除されているが、信号がinduciなので、終止コドンBLE、偽陽性シグナルの発生率は非常に低いです。のCre / loxPをシステム16、17を利用する既存の方法と異なり、我々は"生きて"検出信号を取り込んでいるし、それによって初めて、生体内で細胞融合の動態を追跡する機会を与える。
アプローチを実証するために、普遍的にCreリコンビナーゼを発現するマウスは、floxedストップコドンのルシフェラーゼ下流を表現するための構築物でトランスフェ幹細胞の受信者を務めた。幹細胞は、心筋内注射により移植し、移植生体内の画像解析は、の存在を追跡するために実施された後に時間をかけて心と周囲の組織の融合製品。このアプローチは、開発、疾患や成人の組織修復の任意の段階で任意の組織型における細胞融合を分析するために適合させることができる。
Protocol
Discussion
方法は、小動物を含めて、生物で、初めて、可能にするここで細胞融合の離散的な同定と時間的な分析を説明した。アプローチは、その後のバイオフォトニック画像解析でCre – loxP組換えを兼ね備えています。アプローチだけでなく、細胞 – 細胞融合だけでなく、ウイルスの細胞融合を追跡に適しているので、ウイルス感染を追跡するのに役立つ可能性があります。画像解析は急速であり、そ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、寛大にH1のMSC、と博士はティムのハッカー、博士Gouqingソングとウィスコンシン心臓血管生理学の大学の先生ジルコッホを提供するための博士Peiman Hemmatiを（医学科、ウィスコンシン大学マディソン校）に感謝いたしますマウスの手術を行うための中核施設。この作品は、ブライアンフリーマンとNIH R21 HL089679に大学院研究フェローシップを通じて、全米科学財団によってサポートされていました。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
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