Hücre Fusion Tespit Cre-ETOX P Rekombinasyon Yaklaşım In Vivo</em
Summary
, Zaman içinde canlı organizmaların hücre füzyon izlemek için bir yöntem açıklanmıştır. Yaklaşım kullanır Cre<em> LoxP</em> Rekombinasyon hücre füzyonu üzerine lusiferaz ifade ikna etmek için. Periferik dokularda ~ 1.000 hücrelerinin algılama duyarlılığı ile biyofotonik görüntüleme sistemleri kullanılarak canlı organizmalarda üretilir Işıklı sinyal tespit edilebilir.
Abstract
Sigorta için aynı tipte iki veya daha fazla hücre yeteneği, iskelet, kas, kemik ve plasenta da dahil olmak üzere pek çok kompleks organ, form, evrim boyunca metazoans kullanılmıştır. Çağdaş çalışmalar aynı tip hücrelerin füzyonu gelişmiş fonksiyonu bahşeder göstermektedir. Örneğin, plasenta sigorta trofoblast hücreleri syncytiotrophoblast formu ne zaman, syncytiotrophoblast daha iyi bir halkaya yapışmamış trofoblast 1-4 daha maternal-fetal bariyer boyunca besin ve hormonlar taşımak mümkün. Daha yeni çalışmalarda farklı tipte hücrelerin füzyonu, hücre kaderini doğrudan göstermektedir. Füzyon "reversion" veya hücre kaderinin değiştirilmesi kez hücre kültürü sistemleri ile sınırlı olduğu düşünülüyordu. Ama kök hücre nakli gelişi bize keşfine yol açtı ve, kök hücre in vivo somatik hücre ile sigorta ve kök hücre farklılaşması füzyon 5-7 kolaylaştırır . Böylece, hücre füzyonu düzenlenmiş bir süreç cböylece, hücre yaşamını ve farklılaşmasını teşvik apable ve gelişme, doku onarımı ve hatta hastalığın patogenezinde için merkezi bir önemi olabilir.
Uygun teknoloji eksikliği) 1, hücre füzyon çalışma sınırlandırılması doğru zaman içinde) izlemek füzyon ürünleri füzyon ürünleri belirlemek ve 2. Burada füzyon üzerine biyoparlaklık indüksiyon (Şekil 1) ile iki kısıtlamalarını ortadan kaldırmak için yeni bir yaklaşım mevcut. Biyoparlaklık in vivo 8-15 yüksek hassasiyet ile tespit edilebilir bir yapı ateşböceği lusiferaz kodlama kullanır (Photinus pyralis) gen bitişik yerleştirilen bir stop kodon LoxP dizileri ile çevrili. Cre recombinase protein ifade hücreleri ile bu gen sigorta ifade hücreleri LoxP siteleri bölünmüş ve stop sinyali lusiferaz transkripsiyonunu izin eksize edilir. sinyali induci olduğundanble, yanlış pozitif sinyallerin sıklığı çok düşüktür. Cre / LoxP sistemi 16, 17 kullanan mevcut yöntemlerden farklı olarak, bir "canlı" bir saptama sinyali dahil ve böylece ilk defa hücre füzyon kinetiği, in vivo olarak takip etme olanağı göze.
Yaklaşım göstermek için, yayg Cre recombinase ifade fareler, bir floxed stop kodon lusiferaz downstream ifade etmek için bir yapı ile transfekte kök hücre alıcıları olarak görev yaptı. Kök hücreler intramiyokardiyal enjeksiyon yoluyla nakledilen ve nakli intravital varlığını izlemek için görüntü analizi yapıldı zaman içinde kalp ve çevresindeki dokularda füzyon ürünleri. Bu yaklaşım, geliştirme, hastalık veya yetişkin doku onarımı herhangi bir aşamasında, herhangi bir doku tipi hücre füzyon analiz adapte olabilir.
Protocol
Discussion
Bu yöntem küçük hayvanlar da dahil olmak üzere, canlılar, ilk kez izin verir hücre füzyonu ayrık tanımlama ve temporal analiz tarif. Bu yaklaşım daha sonraki biyofotonik görüntü analizi ile Cre-LoxP rekombinasyon birleştirir. Sadece hücre-hücre füzyonu izlemeye müsait bir yaklaşım, aynı zamanda virüs hücre füzyonu ve benzeri viral enfeksiyonlar izlemek için faydalı olabilir. Görüntü analizi hızlı ve görüntü aynı anda birden fazla küçük hayvanlar için mümkündür. Füzyon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar cömertçe H1 MKH, ve Dr. Tim Hacker, Dr. Gouqing Song ve Wisconsin Kardiyovasküler Fizyoloji Üniversitesi Bayan Jill Koch sağlamak için Dr. Peiman Hemmati (Tıp Fakültesi, University of Wisconsin-Madison) teşekkür etmek istiyorum Fare cerrahisine Core Tesisi. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı tarafından Brian Freeman ve NIH R21 HL089679 Yüksek Lisans Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
Referências
- Bernirschke, K. K. P. . Pathology of the Human Placenta. , (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
- Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy–its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
- Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
- Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
- Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
- Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
- Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
- Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
- Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
- Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O’Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
- Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
- Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
- Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
- Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
- Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
- Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
