A Cre-Lox P Enfoque de recombinación para la detección de la fusión celular En Vivo</em
Summary
Un método para hacer un seguimiento de la fusión celular en los organismos vivos con el tiempo se describe. El enfoque utiliza Cre-<em> LoxP</emRecombinación> para inducir la expresión de luciferasa en la fusión de células. La señal luminosa generada puede ser detectado en los organismos vivos mediante sistemas de biofotónica imágenes con una sensibilidad de detección de ~ 1.000 células en los tejidos periféricos.
Abstract
La capacidad de dos o más células del mismo tipo de fusible se ha utilizado en los metazoos largo de la evolución para formar muchos órganos complejos, incluyendo el músculo esquelético, hueso y placenta. Los estudios contemporáneos demuestran la fusión de células del mismo tipo que le confiere la función mejorada. Por ejemplo, cuando las células trofoblásticas de la placenta el fusible para formar el sincitiotrofoblasto, el sincitiotrofoblasto está en mejores condiciones para el transporte de nutrientes y hormonas a través de la barrera materno-fetal del trofoblasto sin fundir 1-4. Estudios más recientes demuestran que la fusión de células de diferentes tipos pueden dirigir el destino celular. El "retorno" o la modificación de destino de la célula por fusión alguna vez se pensó que limitarse a los sistemas de cultivo celular. Pero el advenimiento del trasplante de células madre llevó al descubrimiento por nosotros y otros que las células madre pueden fusionarse con las células somáticas in vivo y que la fusión facilita la diferenciación de células madre 7.5. Por lo tanto, la fusión celular es un proceso regulado capable de promover la supervivencia y la diferenciación celular y por lo tanto podría ser de vital importancia para el desarrollo, la reparación de los tejidos e incluso la patogénesis de la enfermedad.
La limitación del estudio de la fusión de células, es la falta de tecnología adecuada para 1) identificar con precisión los productos de la fusión y 2) los productos de la pista de fusión con el tiempo. Aquí se presenta un nuevo enfoque para abordar tanto las limitaciones a través de la inducción de la bioluminiscencia en la fusión (Figura 1);. Bioluminiscencia se puede detectar con alta sensibilidad en vivo 15.08 Utilizamos una construcción que codifica para la luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) de genes adyacentes a un codón de parada, flanqueada por secuencias loxP. Cuando las células que expresan este gen fusionan con las células que expresan la proteína recombinasa Cre, los sitios loxP se rompen y la señal de parada se extirpa lo que permite la transcripción de la luciferasa. Debido a que la señal es inducible, la incidencia de falsos positivos señales es muy baja. A diferencia de los métodos existentes que utilizan el sistema Cre / LoxP 16, 17, hemos incorporado un "vivo" de detección de señales y por lo tanto pagar por primera vez la oportunidad para hacer un seguimiento de la cinética de la fusión de células in vivo.
Para demostrar el enfoque, los ratones doquier expresar la recombinasa Cre se desempeñó como receptores de las células madre transfectadas con una construcción de expresar luciferasa aguas abajo de un codón de parada floxed. Las células madre fueron trasplantadas a través de la inyección intramiocárdica y después del trasplante de análisis de imagen intravital se llevó a cabo para rastrear la presencia de productos de fusión en el corazón y los tejidos circundantes a través del tiempo. Este enfoque podría adaptarse para analizar la fusión de células en cualquier tipo de tejido en cualquier etapa del desarrollo, la enfermedad o la reparación de tejidos adultos.
Protocol
Discussion
El método aquí descrito permite, por primera vez, la identificación y el análisis discreto temporal de la fusión de células en los organismos, incluyendo a los animales pequeños. El enfoque combina Cre-loxP recombinación con el posterior análisis de imagen biofotónica. El enfoque puede ser objeto de seguimiento no sólo la fusión entre células, sino también la fusión virus-célula y por lo tanto podría ser útil para el seguimiento de las infecciones virales. Análisis de imágenes es rápida y es posible…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Peiman Hemmati (Departamento de Medicina de la Universidad de Wisconsin-Madison) para ofrecer generosamente los CSM H1, y el Dr. Tim Hacker, Dr. Gouqing canción y la Sra. Jill Koch, de la Universidad de Wisconsin, la fisiología cardiovascular Fondo central para la realización de cirugías de ratón. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia a través de una Beca de Investigación de Postgrado de Brian Freeman y NIH R21 HL089679.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
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