Preparazione T fattore di crescita cellulare da splenociti Rat

Summary

Abbiamo descritto la preparazione del fattore di crescita delle cellule T utilizzato per la espansione in vitro di linee di ratto antigene-specifica dei linfociti T.

Abstract

Manutenzione di linee T antigene-specifiche cellule o cloni in cultura richiede round di antigene-indotta attivazione separate da fasi di espansione delle cellule ^1,2. L'aggiunta di interleuchina 2 al mezzo di coltura durante la fase di espansione è necessario per evitare la morte cellulare e sufficienti per mantenere a breve termine le linee di cellule T, ma ha dimostrato di aumentare la polarizzazione Th1 ^3. Sostituzione di interleuchina 2 da parte del fattore di crescita delle cellule T (TCGF), che contiene un mix di citochine è più efficace di interleuchina 2 nel mantenimento a lungo termine le linee di cellule T in vitro ^3. Inoltre, TCGF può essere facilmente preparato in grandi quantità in laboratorio ed è molto più conveniente rispetto ricombinante interleuchina 2.

Qui mostriamo come preparare TCGF da sovranatanti ratto splenocyte. Per questa procedura, abbiamo raccolto milza di topi Lewis ingenuo eutanasia per timo e la raccolta del sangue. Ci prepariamo a cella singola sospensioni dalla milza, Lyze i globuli rossi da shock osmotico, e la stirpe della splenociti nel terreno di coltura. Le cellule sono stimolate con concanavalina A, un mitogeno che non si attiva selettivamente tutti i linfociti T di ratto, inducendo la produzione di citochine. La cultura è supernantant raccolte 48 ore più tardi andexcess concanavalina A è destinato a mannoside alfa metil per evitare che l'attivazione di linee di cellule T a cui TCGF saranno aggiunti. Il TCGF viene poi filtrata sterile, frazionare e conservati a -20 ° C.

Protocol

Prendere milza ratto Lewis (ratti tra 160-200g sono i migliori). Dilacerate sul ghiaccio in una capsula di Petri contenente PBS + antibiotici (PBS-PS) usando un colino cellulare. Mettere in una provetta da 50 ml. Riempire con PBS-PS. Spin per 10 minuti a 4 ° C per agglomerare le cellule. Lavare le cellule due volte. Risospendere il pellet in NH 4 Cl 0,15 M (5 ml per milza). Mescolare delicatamente e continuamente con una pipetta per 3 minuti sul ghiaccio per la lisi degli eritr…

Discussion

Prepariamo TCGF da splenociti di ratto Lewis da quando abbiamo regolarmente eutanasia ratti ingenuo da questo ceppo alla raccolta del siero e Thymi per stimolare Lewis ratto linee di cellule T in vitro. Questo TCGF può essere utilizzato per promuovere la crescita e la sopravvivenza di linee cellulari T da altri ceppi di topo. TCGF può anche essere preparata da altri ceppi di topi.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
PBS, 1x, sterile	Reagent	Gibco / Invitrogen	14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x	Reagent	Sigma	P0781	Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter	Tool	Fisher	08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Reagent	Sigma	A0171	Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640	Reagent	Gibco / Invitrogen	21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS)	Reagent	Gibco / Invitrogen	16140-071	Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine	Reagent	Cambrex / Biowhittaker	17-718R	PSG
RPMI vitamins, 100x	Reagent	Sigma	R7256
Sodium pyruvate, 100x	Reagent	Sigma	S8636
Non-essential amino acids, 100x	Reagent	Sigma
Beta-mercaptoethanol	Reagent	Sigma	M7522
alpha methyl mannoside	Reagent	Sigma	M6882
Concanavalin A	Reagent	Sigma	M6882

To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercaptoethanol; 2 ug/ml Concanavalin A.