Rat splenositlerin T Hücre Büyüme Faktörü hazırlanması

Summary

Biz, antijen-spesifik sıçan T lenfosit hatları in vitro genişlemesi için kullanılan T hücre büyüme faktörü hazırlık açıklar.

Abstract

Hücre genişleme ^1,2 evreleri ayrılmış antijen-bağlı aktivasyon kültür antijen spesifik T hücre hatları veya klonlar Bakım mermi gerektirir. IL-2, genişleme aşamasında kültür ortamı eklenmesi hücre ölümü önlemek için gerekli ve kısa vadeli T hücre hatları korumak için yeterli ama Th1 ^kutuplaşma 3 artış görülmüştür . Sitokinlerin bir karışımını içeren T hücre büyüme faktörü (TCGF) IL-2 Yedek interlökin 2 ³ in vitro uzun vadeli T hücre hatlarının korunmasında daha etkili. Ayrıca, laboratuvarda büyük miktarlarda TCGF kolayca hazırlanır ve rekombinant interlökin 2 çok daha ucuz olabilir.

Burada, sıçan splenocyte kültür süpernatantlar TCGF nasıl hazırlanacağını gösteriyor. Bu işlem için, biz, timus ve kan toplama için ötenazi naif Lewis sıçan dalak hasat. Biz kültür ortamında dalak, dalak tek hücre süspansiyonları hazırlamak, kırmızı kan hücrelerinin ozmotik şok lyze ve tohum. Concanavalin A, non-selektif olarak sitokinlerin üretimini indükleyen, tüm sıçan T lenfositleri aktive olduğunu mitojenle hücreleri uyarılır. Kültür supernantant andexcess Concanavalin 48 saat sonra toplanan bir TCGF eklendi olacak T hücre hatları aktive önlemek için alfa metil mannoside bağlıdır. TCGF sonra, steril filtrelenmiş aliquoted ve -20 ° C'de saklanır.

Protocol

Lewis sıçan dalak (160-200g arasında fareler en iyi) ele alalım. Bir hücre süzgeç kullanarak PBS + antibiyotikler (PBS-PS) içeren bir petri buz Dilacerate. 50 ml'lik bir tüp içinde koyun. PBS-PS ile doldurun. 4 10 dakika Spin ° C pelet hücreleri. Hücreler iki kez yıkayın. Pelet NH 4 Cl 0.15 M (dalak başına 5 ml) tekrar Eritrositler lyse buz üzerinde 3 dakika süreyle bir pipetlemeyin yavaşça ve sürekli karıştırın. Orta tüp doldurun. 4 10 d…

Discussion

Düzenli olarak naif sıçanlarda serum ve thymi in vitro Lewis sıçan T hücre hatları teşvik etmek için hasat bu gerginlik euthanize beri Lewis sıçan splenositlerin TCGF hazırlar. Bu TCGF diğer sıçan suşları T hücre hatlarının büyüme ve hayatta kalma teşvik etmek için kullanılabilir. TCGF sıçan diğer suşları hazırlanabilir.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
PBS, 1x, sterile	Reagent	Gibco / Invitrogen	14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x	Reagent	Sigma	P0781	Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter	Tool	Fisher	08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Reagent	Sigma	A0171	Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640	Reagent	Gibco / Invitrogen	21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS)	Reagent	Gibco / Invitrogen	16140-071	Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine	Reagent	Cambrex / Biowhittaker	17-718R	PSG
RPMI vitamins, 100x	Reagent	Sigma	R7256
Sodium pyruvate, 100x	Reagent	Sigma	S8636
Non-essential amino acids, 100x	Reagent	Sigma
Beta-mercaptoethanol	Reagent	Sigma	M7522
alpha methyl mannoside	Reagent	Sigma	M6882
Concanavalin A	Reagent	Sigma	M6882

To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercaptoethanol; 2 ug/ml Concanavalin A.