طريقة عملية ومبتكرة لاستخراج الحمض النووي الجينوم من الدم أطقم مجموعة لحفظ البلازما بروتين
Summary
نحن تصف طريقة جديدة لعزل الحمض النووي الجيني من الدم الكامل التي جمعت لبلازما / الأمصال. بعد جمع البلازما، ويتم عادة تجاهل الدم المضغوط. يمثل طريقة لدينا رواية تحسنا كبيرا خلال الأساليب القائمة ويجعل الحمض النووي والبلازما المتاحة من مجموعة واحدة، دون طلب دم إضافية.
Abstract
الاختبارات المعملية يمكن القيام به على الأجزاء الخلوية أو السوائل من الدم. استخدام مختلف أنابيب جمع الدم يحدد جزء من الدم الذي يمكن تحليلها (الدم الكامل، البلازما أو مصل). مختبرات تشارك في دراسة الأساس الجيني للاضطرابات الإنسان تعتمد على الدم الكامل anticoagulated جمعها في vacutainer المحتوية على EDTA-كمصدر من الحمض النووي للتحليل الجيني / الجيني. لأن معظم المختبرات السريرية أداء الكيمياء الحيوية، وإجراء اختبارات مصلية والفيروسية كخطوة أولى في تحقيق نتائج المظهري، ويتم جمع الدم anticoagulated أيضا في أنبوب يحتوي على الهيبارين-(أنبوب البلازما). لذلك عندما تكون هناك حاجة الحمض النووي والبلازما للتحليلات متزامنة ومتوازية من البيانات على حد سواء الجينومية والبروتين، فمن المعتاد أن جمع الدم في كل من EDTA والأنابيب الهيبارين. إذا يمكن جمع الدم في أنبوب واحد، ويكون بمثابة مصدر لكلا البلازما والحمض النووي، وستنظر هذه الطريقة على التقدم إلى المنهجيات القائمةالمواد المستنفدة للأوزون. استخدام الدم المضغوط بعد استخراج البلازما يمثل مصدرا بديلا للالحمض النووي الجيني، وبالتالي التقليل من كمية عينات الدم معالجتها والحد من عدد العينات المطلوبة من كل مريض. وهذا من شأنه في النهاية توفير الوقت والموارد.
تم إنشاء نظام لجمع الدم P100 دينار بحريني لحفظ بروتين البلازما كما تحسن أسلوب أكثر من بلازما السابقة أو جمع المصل أنابيب 1، لتحقيق الاستقرار في محتوى البروتين من الدم، وتحسين واكتشاف العلامات البيولوجية البروتين والبروتينات التجريب من الدم البشري. وBD P100 أنابيب تحتوي على 15.8 مل من K2EDTA مجففة والملكية كوكتيل طيف واسع مجفف بالتجميد من مثبطات الأنزيم البروتيني لمنع تجلط الدم والعمل على استقرار بروتينات البلازما. وهي تشمل أيضا فاصل الميكانيكية، الذي يوفر حاجز مادي بين البلازما والكريات الخلية بعد الطرد المركزي. وقد وضعت عدد قليل من الطرق لاستخراج الحمض النووي من الدم المتجلط SAmples جمعها في أنابيب البلازما القديمة 2-4. وارتبطت التحديات من هذه الأساليب أساسا مع نوع من الفاصل داخل الأنابيب (هلام الفاصل) وشملت صعوبة في استرداد الدم المتجلط، وإزعاج من تفتيت أو تشتيت كلوت، وعرقلة استخراج كلوت بواسطة الجل الفصل.
نقدم الأسلوب الأول الذي يستخرج وينقي الحمض النووي الجيني من الدم تعادل في BD أنابيب P100 جديدة. قارنا نوعية عينة من الحمض النووي من P100 إلى أن أنابيب من أنابيب EDTA. نهجنا هو بسيطة وفعالة. أنها تنطوي على أربع خطوات رئيسية كما يلي: 1) استخدام BD P100 البلازما (تشخيص BD، سباركس، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) أنبوب مع فاصل الميكانيكية لجمع الدم، 2) إزالة الفاصل الميكانيكية باستخدام مزيج من السكروز وعلى العقيمة هوك مشبك معدني، 3) الفصل بين طبقة معطف الشهباء تحتوي على خلايا بيضاء و 4) عزل الحمض النووي الجيني منمعطف الشهباء باستخدام الحمض النووي تجارية عدة استخراج العادية أو بروتوكول قياسي مماثل.
Protocol
Representative Results
Discussion
كثير من الأمراض التي تصيب الإنسان لها أسباب وراثية واستكشاف الأساس الجيني للمرض الإنسان تطالب زيادة الحمض النووي ذات جودة عالية. وanticoagulated المصدر الأكثر شيوعا من الحمض النووي المستخدمة في الدراسات الوراثية الدم الكامل. لأن معظم المختبرات السريرية أداء اختبار الكيم?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Paper clip | Office product | |
| 15 ml tube | Corning | 430052 |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 |
| Bead array reader | Illumina | NA |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
Referências
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101 (2011).
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O’Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
