Een praktische en nieuwe methode om Genomic DNA Uittreksel uit Bloedafname Kits voor Plasma Protein Preservation
Summary
We beschrijven een nieuwe werkwijze voor het isoleren van genomisch DNA uit volbloed voor plasma / serologie. Na het plasma, wordt de verdichte bloed meestal weggegooid. Onze nieuwe methode is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van bestaande methoden en maakt DNA en plasma verkrijgbaar vanaf een enkele collectie, zonder daarvoor extra bloed.
Abstract
Laboratoriumonderzoek kan de cellulaire of vloeibare delen van het bloed. Het gebruik van verschillende bloedafnamebuisjes vastgesteld welk deel van het bloed dat kan worden geanalyseerd (volbloed, plasma of serum). Laboratoria betrokken bij het bestuderen van de genetische basis van menselijke aandoeningen afhankelijk anti-gecoaguleerd bloed in EDTA-bevattende vacutainer verzameld als bron van DNA voor genetische / genomische analyse. Omdat de meeste klinische laboratoria voeren biochemische, serologische en virale testen als een eerste stap in de fenotypische uitkomst onderzoek wordt ontstold bloed ook verzameld in heparine bevattende buis (plasma buis). Daarom als DNA en plasma nodig voor gelijktijdige en parallelle analyses van zowel genomische en proteomische gegevens, is het gebruikelijk om bloed te verzamelen in zowel EDTA en heparine buizen. Als bloed in een buis verzameld kunnen worden en dienen als een bron voor zowel plasma als DNA, zou deze werkwijze worden beschouwd als een plaatsing in bestaande methods. Het gebruik van het gecomprimeerde bloed plasma na extractie is een alternatieve bron van genomisch DNA, dus het minimaliseren van de hoeveelheid bloed monsters verwerkt en het aantal benodigde monsters van elke patiënt. Dit zou uiteindelijk bespaart tijd en middelen.
De BD-P100 bloedafnamesysteem voor plasma-eiwit conservering werden geschapen als een verbeterde methode ten opzichte van eerdere plasma of serum collectie buizen 1, om het eiwitgehalte van het bloed te stabiliseren, waardoor een betere eiwit biomarker ontdekking en proteomics experimenten uit menselijk bloed. De BD P100 buisjes bevatten 15,8 ml gesproeidroogde en gevriesdroogde K2EDTA eigen breed spectrum cocktail van proteaseremmers coagulatie te voorkomen en de plasma-eiwitten te stabiliseren. Ze hebben ook een mechanische afscheider, die een fysieke barrière tussen plasma en celpellets na centrifugeren biedt. Enkele werkwijzen zijn ontwikkeld om DNA extraheren uit gestold bloed samples opgevangen in oude plasma buizen 2-4. Uitdagingen deze methoden werden voornamelijk geassocieerd met het type afscheider in de buizen (gel separator) en inclusief moeite terugwinnen van het gestolde bloed, het ongemak te fragmenteren of dispergeren van de klonter en obstructie van de klonter extractie van de gel.
We presenteren de eerste methode die extracten en zuivert genomisch DNA uit bloed getrokken in de nieuwe BD-P100 buizen. Wij vergelijken de kwaliteit van het DNA monster van P100 buizen die uit EDTA-buisjes. Onze benadering is eenvoudig en efficiënt. Het gaat om vier grote stappen als volgt: 1) het gebruik van een plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) buis met mechanische afscheider voor bloedafname, 2) de verwijdering van de mechanische afscheider met een combinatie van sucrose en een steriele paperclip metalen haak 3) het scheiden van de buffy coat laag die de witte cellen en 4) het isoleren van het genomische DNA van debuffy coat met een gewone commerciële DNA-extractie kit of een vergelijkbare standaard protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vele menselijke ziekten hebben genetische oorzaken en onderzoeken de genetische basis van menselijke ziekten vereist een toenemende hoge kwaliteit DNA. De meest voorkomende bron van DNA gebruikt in genetische studies wordt anticoagulated volbloed. Omdat de meeste klinische laboratoria voeren biochemische, serologische, en virale testen als een eerste stap in de fenotypische uitkomst onderzoek, wordt het bloed vaak opgevangen in een plasma buis. Na het verzamelen van het plasma, wordt de verdichte bloed vaak weggegooid. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Paper clip | Office product | |
| 15 ml tube | Corning | 430052 |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 |
| Bead array reader | Illumina | NA |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
Referências
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101 (2011).
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O’Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
