Un metodo pratico e innovativo per estrarre il DNA genomico da kit di raccolta del sangue per Plasma Proteina Preservation

Summary

Stiamo descrivendo un nuovo procedimento per isolare DNA genomico da sangue intero prelevato per plasma / sierologia. Dopo la raccolta del plasma, il sangue compattato viene solitamente scartata. Il nostro nuovo metodo rappresenta un miglioramento significativo rispetto ai metodi esistenti e rende il DNA e plasma disponibili da una singola collezione, senza richiedere ulteriore sangue.

Abstract

Test di laboratorio possono essere praticati sulle porzioni cellulari o fluido del sangue. L'uso di diverse provette determina la porzione del sangue che può essere analizzato (sangue intero, plasma o siero). Laboratori coinvolti nello studio delle basi genetiche delle malattie umane si basano su anticoagulante del sangue intero prelevato in EDTA contenente vacutainer come fonte di DNA per l'analisi genetica / genomica. Perché laboratori clinici di eseguire più test biochimici, sierologici e virali come un primo passo in un'indagine risultato fenotipico, il sangue coagulato è anche raccolto in provetta contenente eparina (tubo plasma). Pertanto quando sono necessarie DNA e plasma per analisi simultanea e parallela di dati sia genomici e proteomici, è consuetudine per raccogliere il sangue in EDTA e sia con eparina. Se sangue potrebbe essere raccolto in un unico tubo e servire come fonte sia per plasma e DNA, tale metodo sarebbe considerato un avanzamento a met esistentiods. L'utilizzo del sangue compattato dopo estrazione plasma rappresenta una fonte alternativa per il DNA genomico, minimizzando così la quantità di campioni di sangue trasformati e riducendo il numero di campioni richiesti da ogni paziente. Ciò finirebbe per risparmiare tempo e risorse.

Il P100 sistema di raccolta del sangue BD per la conservazione delle proteine ​​del plasma sono stati creati come un metodo migliorato nel corso del plasma precedente o raccolta siero tubi ^1, per stabilizzare il contenuto proteico del sangue, consentendo una migliore proteina scoperta di biomarcatori e proteomica sperimentazione dal sangue umano. I tubi P100 BD contengono 15,8 ml di K2EDTA essiccato a spruzzo e un liofilizzato proprietaria ampio spettro cocktail di inibitori di proteasi per prevenire la coagulazione e stabilizzare le proteine ​​plasmatiche. Essi includono anche un separatore meccanico, che fornisce una barriera fisica tra plasma e pellet cellulari dopo centrifugazione. Pochi metodi sono stati studiati per estrarre il DNA da sangue coagulato SAmples raccolti nei vecchi tubi di plasma ^2-4. Sfide da questi metodi sono stati principalmente associati con il tipo di separatore all'interno dei tubi (separatore di gel) ed inclusi difficoltà di recupero del sangue coagulato, l'inconveniente di frammentare o disperdendo il coagulo e ostruzione del coagulo estrazione dal gel di separazione.

Vi presentiamo il primo metodo che estrae e purifica il DNA genomico da sangue prelevato nei nuovi P100 tubi BD. Si confronta la qualità del campione di DNA da P100 tubi, a quella in provette EDTA. Il nostro approccio è semplice ed efficiente. Si tratta di quattro fasi principali, come segue: 1) l'uso di un BD P100 plasma (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tubo con separatore meccanico per la raccolta del sangue, 2) la rimozione del separatore meccanico utilizzando una combinazione di saccarosio e di un sterile graffetta gancio metallico, 3) la separazione dello strato di buffy coat contenente le cellule bianche e 4) l'isolamento del DNA genomico dalbuffy coat utilizzando un kit di estrazione del DNA normale commerciale o un protocollo standard simile.

Protocol

1. Raccolta dei campioni Raccogliere campioni di sangue di soggetti con adeguata consenso informato. Per ogni individuo, trarre 4-5 ml di sangue in una provetta P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). A scopo di confronto, raccogliere contemporaneamente il sangue in una provetta con EDTA. I tubi P100 BD contengono 15,8 ml K2EDTA essiccato a spruzzo e un liofilizzato proprietaria ampio spettro cocktail di inibitori di proteasi per prevenire la coagulazione e stabilizzare le proteine ​​plas…

Representative Results

Valutazione della qualità del DNA e la misura della concentrazione Le rese di P100_DNAs erano significativamente inferiori a quelli di EDTA_DNAs (Tabelle 1 e 2). La purezza del DNA rappresentata dal valore 260/280 rapporto è simile per entrambi P100_DNA e set di esempio EDTA_DNA (Tabelle 1 e 2). La qualità del DNA è abbastanza uniforme all'interno di ogni serie di campioni sebbene alcuni degradazione è visto nei campio…

Discussion

Molte malattie umane hanno cause genetiche ed esplorare la base genetica delle malattie umane richiede una crescente DNA di alta qualità. La fonte più comune di DNA utilizzato in studi genetici è coagulato sangue intero. Poiché laboratori più eseguire test biochimici clinici, sierologici, e virali come primo passo in esito indagine fenotipica, il sangue viene spesso raccolta in un tubo plasma. Dopo la raccolta del plasma, il sangue compattato viene spesso scartato. Pertanto, quando il DNA è necessario per condurre…

Materials

Name of the reagent/equipment	Company	Catalogue number
BD P100 tubes	BD Diagnostics	366448
EDTA tubes	BD Diagnostics	367863
Sucrose	Sigma	S9378
Paper clip	Office product
15 ml tube	Corning	430052
Red blood cells (RBC)	Qiagen	158389 (kit)
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)	Qiagen	940054
1.7 ml microtubes	Axygen	MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit	Illumina	WG-352-1001
Bead array reader	Illumina	NA
GenomeStudio Software	Illumina	N/A