تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي
Summary
وقد وضعنا مقايسة الانصهار خلية يحدد مقدار كمين بوساطة الانصهار غشاء من الأحداث تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-.
Abstract
تفاعلات الفخ (ق oluble N-ethylmaleimide تراعي عامل البروتين إعادة متقبل ttachment) البروتينات على حويصلات (V-الافخاخ) وعلى الأغشية الهدف (T-الافخاخ) تحفيز الخلايا الانصهار الحويصلة 1-4. المقايسات ضرورية لإعادة تشريح آلية وتنظيم الانصهار غشاء كمين بوساطة 5. في خلية الانصهار 6،7 الفحص، يتم التعبير عن البروتينات الفخ ectopically على سطح الخلية. هذه "انقلبت" محرك الخلية البروتينات الفخ خلايا الانصهار، مما يدل على أن الافخاخ تكفي لصهر الأغشية الخلوية. لأنه يعتمد الفحص على خلية الانصهار التحليل المجهري، فمن أقل كفاءة عندما تستخدم لتحليل متعددة V-T-والتفاعلات كمين كميا.
نحن هنا وصف الفحص الجديدة 8 يحدد مقدار كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-. اثنانوتستخدم عناصر منظومة الجينات التعبير تيت أوف 9 بمثابة نظام قراءات: في transactivator التتراسيكلين التي تسيطر عليها (TTA) ومراسل البلازميد الذي يشفر الجين LacZ تحت سيطرة العنصر التتراسيكلين والاستجابة (TRE-LacZ). نحن بالنقل نقل واكتساب التكنولوجيا في الخلايا COS-7 التي تعبر عن انعكاس V-كمين البروتينات على سطح الخلية (الخلايا V-) وبالنقل TRE-LacZ في الخلايا COS-7 التي تعبر عن انعكاس تي في كمين البروتينات على سطح الخلية (الخلايا التائية) . التي تعتمد على الانصهار كمين للV-والنتائج (خلايا تي) في ملزمة من نقل واكتساب التكنولوجيا لTRE، تفعيل الترانسكربتي من LacZ والتعبير عن غالاكتوزيداز β-. وكميا نشاط غالاكتوزيداز β-اللونية باستخدام طريقة الامتصاص من قبل في 420 نانومتر.
غشاء الحويصلة البروتينات المرتبطة (الرقعات) هي V-الافخاخ الموجودة في حجرات بعد غولجي مختلف حويصلي 10-15. بالإعراب عن الرقعات 1 و 3 و 4 و 5 و 7 و 8 على نفس المستوى، على قارنا الانصهار الغشاءأنشطة باستخدام الانصهار خلية الأنزيمية فحص. القياس الطيفي على أساس هذا الفحص يوفر النهج الكمي لتحليل كمين بوساطة الانصهار غشاء والإنتاجية العالية للدراسات.
Protocol
Representative Results
Discussion
انصهار الخلية الأصلية مقايسة 6 يحدد كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية بواسطة المجهر مضان. نحن هنا وصف لفحص مبتكرة يحدد مقدار كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-وقياس الطيفي. باستخدام هذا الاختبار، نحن نحلل بشكل روتيني 15 حتي 20-V و T…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من جامعة لويزفيل وCA135123 من المعاهد الوطنية للصحة (لCH).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
Referências
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs – VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release – four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
