Analyse de la fusion membranaire médiée SNARE en utilisant un dosage enzymatique cellulaire Fusion
Summary
Nous avons développé un test de fusion cellulaire qui quantifie SNARE médiées par les événements de fusion membranaire activé par l'expression de la β-galactosidase.
Abstract
Les interactions des SNARE (s oluble N-éthylmaléimide facteur sensible à un ceptor re IÈCE JOINTE protéines) sur les protéines des vésicules (v-SNARE) et sur les membranes cibles (t-SNARE) catalyser la fusion des vésicules intracellulaires 1-4. Essais de reconstitution sont essentiels pour disséquer le mécanisme et la régulation de la fusion membranaire médiée SNARE 5. Dans un dosage de 6,7 fusion cellulaire, les protéines sont exprimées SNARE ectopique à la surface cellulaire. Ces "retourné" SNARE entraînement protéines de fusion cellule-cellule, ce qui démontre que SNAREs sont suffisantes pour faire fondre les membranes cellulaires. Parce que le dosage de la fusion cellulaire est basée sur l'analyse microscopique, il est moins efficace lorsqu'il est utilisé pour analyser les multiples v-et t-SNARE interactions quantitativement.
Nous décrivons ici un nouveau dosage 8 qui quantifie SNARE médiées par les événements de fusion cellulaire activé par l'expression de la β-galactosidase. Deuxles composants du système Tet-Off expression génique 9 sont utilisées comme un système de lecture: le transactivateur de tétracycline-commandé (tTA) et un plasmide rapporteur qui code pour le gène LacZ sous le contrôle de l'élément de réponse à la tétracycline (TRE-LacZ). Nous transfecter tTA en cellules COS-7 exprimant v-SNARE retournées protéines à la surface cellulaire des cellules (v) et transfecter TRE-LacZ dans les cellules COS-7 exprimant retournées t-SNARE protéines à la surface cellulaire (cellules T) . SNARE dépendant de la fusion des v-et t-cellules entraîne la liaison de tTA au TRE, l'activation de la transcription de LacZ et d'expression de la β-galactosidase. L'activité de la β-galactosidase est quantifié en utilisant une méthode colorimétrique par absorbance à 420 nm.
Les protéines de la membrane des vésicules associées (Vamps) sont v-SNARE qui résident dans différents post-Golgi compartiments vésiculaires 10-15. En exprimant Vamps 1, 3, 4, 5, 7 et 8 du même niveau, on compare leur fusion membranaireactivités à l'aide du dosage enzymatique cellule de fusion. Basé sur la mesure spectrométrique, cet essai propose une approche quantitative pour l'analyse de la fusion membranaire médiée SNARE et à haut débit études.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dosage de la fusion cellulaire d'origine 6 détermine SNARE médiation événements de fusion de cellules par microscopie à fluorescence. Nous décrivons ici un test innovant qui permet de quantifier SNARE médiées par les événements de fusion cellulaire activé par l'expression de la β-galactosidase et la mesure spectrométrique. En utilisant ce test, nous avons l'habitude d'analyser 15 à 20 V et t-SNARE combinaisons en une seule expérience. En utilisant la cytométrie en flux pour …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par des fonds de démarrage de l'Université de Louisville et CA135123 du National Institutes of Health (au CH).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
Referências
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