Analyse der SNARE-vermittelte Membranfusion Verwendung eines enzymatischen Cell Fusion Assay
Summary
Wir haben eine Zellfusion Assay, SNARE-vermittelte Membranfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase entwickelt.
Abstract
Die Interaktionen von SNARE (s oluble N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor a ttachment Protein re Rezeptor)-Proteine auf Vesikeln (v-SNARE) und Zielmembranen (t-SNAREs) katalysieren intrazellulären Vesikelfusion 1-4. Rekonstitution Assays sind für Sezieren des Mechanismus und Regulation des SNARE-vermittelte Membranfusion 5. In einer Zellfusion Assay 6,7 sind SNARE-Proteine ektopisch an der Zelloberfläche exprimiert wird. Diese "umgedreht" SNARE-Proteine Laufwerk Zell-Zell-Fusion, die belegen, dass SNAREs ausreichen, um Zellmembranen fusionieren werden. Weil der Zellfusion Assay auf mikroskopische Analyse basiert, ist es weniger effizient, wenn verwendet, um mehrere v-und t-SNARE Wechselwirkungen quantitativ zu analysieren.
Hier beschreiben wir einen neuen Assay 8, SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase. Zweidas Tetracyclin-gesteuerten Transaktivator (tTA) und ein Reporterplasmid, das die LacZ-Gen unter Kontrolle des Tetracyclin-Response-Element (TRE-LacZ) kodiert: Komponenten des Tet-Off Genexpressionssystem 9 sind als eine Auslese-System verwendet. Wir transfizieren tTA in COS-7 Zellen, die umgedreht V-SNARE-Proteine auf der Zelloberfläche (v-Zellen) und transfizieren TRE-LacZ in COS-7 Zellen, die umgedreht T-SNARE-Proteine auf der Zelloberfläche (t-Zellen) . SNARE-abhängigen Fusion der v-und t-Zellen führt zur Bindung von tTA an TRE, die transkriptionale Aktivierung von LacZ und Expression von β-Galactosidase. Die Aktivität von β-Galactosidase wird quantifiziert unter Verwendung eines kolorimetrischen Verfahren durch Absorption bei 420 nm auf.
Die Vesikel-assoziiertes Membranproteine (Vamps) sind v-SNAREs, die in verschiedenen Post-Golgi vesikulären Kompartimenten befinden 10-15. Durch Expression VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 und 8 auf dem gleichen Niveau, zu vergleichen wir ihre MembranfusionAktivitäten unter Verwendung des enzymatischen Zellfusion Assay. Basierend auf spektrometrische Messung, bietet dieser Test einen quantitativen Ansatz zur Analyse von SNARE-vermittelte Membranfusion und für High-Throughput-Studien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Originalbild Zellfusion Assay 6 bestimmt SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse durch Fluoreszenzmikroskopie. Hier beschreiben wir eine innovative Assay, SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase und spektrometrische Messung. Unter Verwendung dieses Tests analysieren wir routinemäßig 15-20 v-und t-SNARE-Kombinationen in einem einzigen Experiment. Mittels Durchflusszytometrie zur SNARE-Expression auf der Zelloberfläche zu messen, zu titrieren wir d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch Anschubfinanzierung von der University of Louisville und CA135123 von den National Institutes of Health (bis CH) unterstützt.
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
Referências
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs – VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release – four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
