Análisis de la fusión de la membrana SNARE mediada usando un ensayo de fusión celular enzimática
Summary
Hemos desarrollado un ensayo de fusión celular que cuantifica SNARE mediada por los acontecimientos de fusión de membrana por la expresión activa de β-galactosidasa.
Abstract
Las interacciones de las SNARE (s oluble N-etilmaleimida factor sensible a una proteína ttachment ceptor re) proteínas en vesículas (v-SNARE) y en membranas diana (t-SNARE) catalizan la fusión de vesículas intracelulares 1-4. Ensayos de reconstitución son esenciales para disecar el mecanismo y la regulación de la fusión de membranas mediada por 5-SNARE. En un ensayo de fusión celular 6,7, las proteínas SNARE se expresan ectópicamente en la superficie celular. Estos "volteado" SNARE unidad proteínas de fusión célula-célula, lo que demuestra que trampas son suficientes para fusionar las membranas celulares. Debido a que el ensayo de fusión celular se basa en el análisis microscópico, que es menos eficiente cuando se usa para analizar múltiples interacciones y v-t-SNARE cuantitativamente.
Aquí se describe un nuevo ensayo que cuantifica 8 SNARE mediada por los acontecimientos de fusión celular activado por la expresión de β-galactosidasa. Doscomponentes del sistema de genes Tet-Off expresión 9 se utiliza como un sistema de lectura: el transactivador controlado por tetraciclina (tTA) y un plásmido informador que codifica el gen LacZ bajo el control del elemento de respuesta de tetraciclina (TRE-LacZ). Nos transfectar tTA en células COS-7 que expresan volteado v-SNARE proteínas en la superficie celular (V-células) y transfección de TRE-LacZ en células COS-7 que expresan volteado t-SNARE proteínas en la superficie celular (células T) . SNARE dependiente de la fusión de la V-y las células T resulta en la unión de tTA a TRE, la activación transcripcional de LacZ y la expresión de β-galactosidasa. La actividad de β-galactosidasa se cuantificó usando un método colorimétrico por absorbancia a 420 nm.
Las proteínas asociadas a la membrana de vesículas (vampiros) son v-SNARE que residen en diferentes compartimentos de Golgi post-vesiculares 10-15. Mediante la expresión de VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 y 8 en el mismo nivel, se compara su fusión de membranasactividades utilizando el ensayo de células de fusión enzimática. Sobre la base de la medición espectrométrica, este ensayo ofrece un enfoque cuantitativo para el análisis de SNARE mediada por fusión de membranas y para estudios de alto rendimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de células fusión original 6 determina mediadas SNARE-eventos de fusión de células mediante microscopía de fluorescencia. Aquí se describe un ensayo que cuantifica innovador SNARE mediada por los acontecimientos de fusión celular activado por la expresión de β-galactosidasa y la medición espectrométrica. Usando este ensayo, se analizan rutinariamente 15 a 20 y v-t-SNARE combinaciones en un solo experimento. Usando citometría de flujo para medir la expresión SNARE en la superficie celula…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Louisville y CA135123 de los Institutos Nacionales de Salud (para CH).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
Referências
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