Analisi delle SNARE-mediata fusione della membrana L'utilizzo di un test enzimatico fusione cellulare
Summary
Abbiamo sviluppato un saggio fusione cellulare che quantifica SNARE mediati eventi di fusione della membrana mediante espressione di β-attivato galattosidasi.
Abstract
Le interazioni di SNARE (s oluble N-ethylmaleimide sensibile al fattore di una proteina recettore ttachment ri) proteine sulla vescicole (v-SNARE) e membrane bersaglio (t-SNARE) catalizzano la fusione della vescicola intracellulare 1-4. Saggi di ricostituzione, sono essenziali per la dissezione del meccanismo e la regolazione di SNARE-mediata fusione della membrana 5. In un saggio di fusione cellulare 6,7, proteine SNARE sono espresse ectopicamente alla superficie cellulare. Questi "girato" SNARE unità proteine fusione cellula-cellula, dimostrando che SNARE sono sufficienti per fondere le membrane cellulari. Poiché il saggio fusione cellulare si basa su analisi microscopica, è meno efficace quando viene utilizzato per analizzare multiple e v-t-SNARE interazioni quantitativamente.
Qui si descrive un nuovo saggio 8 che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule dall'espressione attiva di β-galattosidasi. Duecomponenti del sistema Tet-Off genica 9 sono utilizzati come visualizzatore sistema: la tetraciclina controllato transattivatore (tTA) ed un plasmide reporter che codifica il gene lacZ sotto il controllo della tetraciclina-risposta elemento (TRE-LacZ). Abbiamo transfect tTA in cellule COS-7 che esprimono capovolte v-SNARE proteine sulla superficie cellulare (V-cellule) e trasfezione TRE-LacZ in cellule COS-7 che esprimono capovolte t-SNARE proteine sulla superficie cellulare (cellule T) . SNARE-dipendente fusione delle V-e cellule T determina il legame di tTA al TRE, l'attivazione trascrizionale di LacZ e espressione di β-galattosidasi. L'attività di β-galattosidasi è quantificato mediante un metodo colorimetrico mediante assorbimento a 420 nm.
Le vescicole associate proteine di membrana (vampiri) sono v-SNARE che risiedono in vari post-Golgi compartimenti vescicolari 10-15. Esprimendo VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 e 8 allo stesso livello, si confronta la fusione della membranaattività che utilizzano il enzimatica fusione cellulare. Basata sulla misura spettrometrica, questo saggio offre un approccio per l'analisi quantitativa SNARE-mediata fusione della membrana e di alta produttività studi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio originale fusione cellulare 6 determina SNARE mediati eventi di fusione cellulare mediante microscopia a fluorescenza. Qui si descrive un saggio innovativo che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule di espressione attiva di β-galattosidasi e la misurazione spettrometrica. Questo test, si analizzano routinariamente 15-20-v e t-SNARE combinazioni in un singolo esperimento. Citometria a flusso per misurare SNARE espressione sulla superficie cellulare, abbiamo titolare i livelli di espre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto da fondi di avvio presso l'Università di Louisville e CA135123 dal National Institutes of Health (per CH).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
Referências
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