İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon
Summary
Birincil insan fibroblast ikinci naif multipotent ten türetilmiş öncü (SKP) hücreleri izole etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Biz fibroblast kültürleri elde edilen bu SKPS insan deri biyopsisi doğrudan elde benzeyen kök hücre özelliklerini paylaşmak olduğunu göstermektedir. Bu hücreler, örneğin Oct4 ve Nanog olarak multipotent işaretleri ek olarak nöral tepe işaretleyici, Nestin, ifade eder.
Abstract
Son on yılda, birçok yetişkin kök hücre popülasyonlarının insan derisi 1-4 tespit edilmiştir. Multipotent yetişkin dermal öncüleri izolasyonu ilk Miller F. D laboratuarı 5, 6 tarafından bildirildi. Bu ilk çalışmalar yetişkin memeli dermis 5 Bir multipotent öncül hücre popülasyonu nitelendirdi. Bu hücreler – adlandırılan SKPS, cilt kaynaklı öncüleri için – izole ve kemirgen ve insan derisi genişletilmiş ve bu nöronlar 5 gibi deride bulmadım hücre tipleri de dahil olmak üzere sinir ve mezodermal hem döl, içine ayırt edildi. Kültür SKPS üzerinde immünositokimyasal çalışmalar hücre fibronektin ve multipotent kök hücre işaretleyicileri 6 ek olarak vimentin ve Nestin, sinir ve kas öncüleri olarak ifade bir ara filaman proteini ifade olduğunu ortaya koymuştur. Şimdiye kadar, yetişkin kök hücreleri nüfus SKPS yeni toplanmış memeli biyopsi izole edilmiştir.
ve_content "> Son zamanlarda, kurulan ve cilt elde öncü hücreler nüfusu biyopsi 7 kurulan primer fibroblast kültürlerinde mevcut kalabileceklerini bildirdi. birkaç somatik kök hücreleri erken nüfus çiftlenmeler birincil fibroblast kültürlerinde ikamet olabilir varsayım oldu Aşağıdaki gözlemlerine dayanarak: (1) SKPS ve primer fibroblast kültürleri dermis türetilmiştir ve SKP hücrelerin bu nedenle az sayıda birincil dermal fibroblast kültürlerinde mevcut kalamayacağını ve (2) primer fibroblast kültürleri olmuştur dondurulmuş alikotları büyüdü 7 yaşayabilecek durumda kalır küçük bir hücre sayısı bulunan depolama ve nakil sırasında uygun olmayan bir sıcaklığa maruz. Bu nadir hücreleri birkaç kez genişletmek ve geçişli olabilir başardık. Bu gözlem, önerilen, yüksek proliferasyon gücü ve strese karşı direnci olan küçük bir hücre sayısı insan fibroblast kültürlerinde 7 mevcuttu.Biz dünya çapında doku bankaları (Şekil 1) temin edilebilir primer fibroblast kültürlerden yetişkin kök hücrelerin hızlı izolasyonu için bir protokol oluşturmak için bu bulguların yararlandı. Deri örnekleri erişilemez zaman fibroblast kültürleri içinde moleküler nadir genetik hastalıkların altında yatan mekanizmaların yanı sıra modelleme hastalıkları incelemek için yeni fırsatlar açılması, böylece, doku bankalardan bulunabilir ederken öncü hücrelerin izolasyonu sağlayan bu yöntem önemli bir öneme sahip çanak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu tarifnamede anlatılan yöntem kullanılarak, naif dermal kök hücrelerin, birincil deri fibroblast izole edilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak, son zamanlarda nadir görülen genetik bir sendrom, Hutchinson-Gilford progeria sendromu 7 hastalarda elde edilen fibroblast kültürlerden erişkin kök hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu rapor. Gibi bu öncü hücreler ifade kök hücre belirteçleri kendini yenileme yeteneğine sahiptir ve (lütfen Wenzel ve ark. Tarafından 4 bkz.,</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Alexander von Humboldt Vakfı (5090371), Anti Araştırma ve Eğitim Christine Kühne Merkezi (CK-CARE) ve Bayerischen Staatsministerium (KD için) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
Referências
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, l. K. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
