Naïve cellules souches adultes Isolation de cultures de fibroblastes humains primaires

Summary

Nous rapportons une méthode pour isoler les cellules naïves multipotentes précurseurs dérivés de la peau (SKP) à partir de cultures de fibroblastes humains primaires. Nous montrons que ces SKPs issus de cultures de fibroblastes partagent des propriétés semblables des cellules souches à celles provenant directement de biopsies de peau humaine. Ces cellules expriment le marqueur de la crête neurale, nestine, en plus des marqueurs tels que OCT4 multipotentes et Nanog.

Abstract

Au cours de la dernière décennie, plusieurs populations de cellules souches adultes ont été identifiés dans la peau humaine ^1-4. L'isolement des précurseurs dermiques adultes multipotentes a d'abord été rapporté par Miller F. D laboratoire ^{5, 6.} Ces premières études ont décrit une population de cellules précurseurs pluripotentes à partir de derme des mammifères adultes ^5. Ces cellules – SKP appelés, pour les précurseurs dérivés de la peau – ont été isolés et sont passées de rongeurs et de la peau humaine et différenciées en neurones et deux descendants du mésoderme, y compris les types de cellules jamais trouvés dans la peau, comme les neurones ^5. Des études immunocytochimiques sur SKPs culture ont révélé que les cellules expriment la vimentine et la nestine, une protéine de filament intermédiaire exprimé des précurseurs neuronaux et musculaires squelettiques, en plus de la fibronectine et des marqueurs de cellules souches multipotentes ^6. Jusqu'à présent, les cellules souches SKPs la population adulte ont été isolés à partir de biopsies de peau de mammifère fraîchement récoltées.

ve_content "> Récemment, nous avons mis en place et a indiqué que la population de la peau des cellules précurseurs dérivées pourrait rester présente dans des cultures de fibroblastes primaires établies à partir de biopsies de la peau ^7. L'hypothèse selon laquelle un petit nombre de cellules souches somatiques pourraient résider dans des cultures de fibroblastes primaires de doublements de population au début était basées sur les observations suivantes: (1) SKPs et les cultures de fibroblastes primaires proviennent du derme, et donc un petit nombre de cellules SKP pourraient rester présente dans les cultures de fibroblastes dermiques primaires et (2) des cultures de fibroblastes primaires cultivées à partir de portions congelées qui ont été soumis à une température défavorable pendant le stockage ou le transfert contenait un petit nombre de cellules qui sont restées viables ^7. Ces cellules rares étaient capables de développer et pourrait être repiquées plusieurs fois. Cette observation suggère qu'un petit nombre de cellules avec une puissance de prolifération élevé et la résistance au stress étaient présents dans les cultures de fibroblastes humains ^7.

Nous avons profité de ces résultats pour établir un protocole pour l'isolement rapide des cellules souches adultes à partir de cultures de fibroblastes primaires qui sont facilement disponibles à partir de banques de tissus à travers le monde (Figure 1). Cette méthode a une signification importante car elle permet d'isoler des cellules précurseurs lorsque des échantillons de peau ne sont pas accessibles alors que les cultures de fibroblastes peuvent être disponibles à partir de banques de tissus, ainsi, ouvrir de nouvelles opportunités pour disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les maladies génétiques rares ainsi que les maladies de modélisation dans un Antenne.

Protocol

1. Isolation SKP partir des cultures de fibroblastes primaires des cultures de fibroblastes ou l'autre des banques de cellules ou directement obtenu à partir de biopsies de peau sont maintenues en culture en croissance des fibroblastes du milieu DMEM contenant 15% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine, 10 mg / ml de pénicilline et 10 mg / ml de streptomycine. Fibroblastes humains GMO3349C et GMO8398A ont été obtenus à partir de l'Institut Coriell pour la r…

Representative Results

Nous montrons qu'une population de cellules qui augmentent de manière sélective pour générer des sphères SKP sous condition d'une croissance maîtrisée, comprenant des EGF et FGF2 sont présents dans les cultures de fibroblastes dermiques primaires (Figure 1) Comme nous l'indiquions récemment 7. des cultures de fibroblastes de PPD 15 à 25, qui correspondent généralement aux souches de fibroblastes primaires disponibles à partir de banques de…

Discussion

En utilisant la méthode décrite ici, les cellules souches dermiques naïfs peuvent être isolés à partir de cultures de fibroblastes dermiques primaires. Grâce à cette approche, nous avons récemment signalé l'isolement et la caractérisation des cellules souches adultes à partir de cultures de fibroblastes provenant de patients atteints d'un syndrome génétique rare, Hutchinson-Gilford progeria syndrome ^7. Comme le montrent ici les cellules marqueurs de cellules souches expriment précurseur…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.