Apresentamos um método para isolar as células multipotentes ingênuos precursoras da pele derivada (SKP) de culturas de fibroblastos humanos primários. Mostra-se que estas SKPs derivados a partir de culturas de fibroblastos de células estaminais partilham propriedades semelhantes às derivadas directamente a partir de biópsias de pele humana. Estas células expressam o marcador da crista neural, nestina, para além dos marcadores, tais como OCT4 multipotentes e Nanog.
Ao longo da última década, várias populações de células estaminais adultas foram identificadas na pele humana 1-4. O isolamento de precursores dérmicos adultas multipotentes foi primeiramente relatada por F. Miller D laboratório 5, 6. Estes estudos iniciais descreveu uma população de células multipotentes precursor do adulto derme mamíferos 5. Estas células – SKPs denominados precursores, para a pele derivadas – foram isoladas e expandidas do roedor e a pele humana e diferenciar-se em progenitura tanto neural e mesodérmica, incluindo os tipos de células nunca encontradas na pele, tais como os neurónios 5. Estudos imunocitoquímicos sobre SKPs revelou que as células cultivadas expressaram vimentina e nestina, uma proteína de filamento intermédia expresso em precursores neurais do músculo esquelético e, em adição à fibronectina e marcadores de células estaminais multipotentes 6. Até agora, as células estaminais adultas SKPs população têm sido isoladas de recém-coletadas biópsias de pele de mamíferos.
ve_content "> Recentemente, nós estabelecemos e informou que uma população de células precursoras derivadas da pele pode permanecer presente em culturas de fibroblastos primários estabelecidos a partir de biópsias de pele 7. A suposição de que algumas células-tronco somáticas pode residir em culturas de fibroblastos primários em duplicações da população início era baseada nas seguintes observações: (1) SKPs e culturas de fibroblastos primários são derivados a partir da derme, e, por conseguinte, um pequeno número de células SKP podem permanecer presentes em culturas de fibroblastos dérmicos primários e (2) culturas de fibroblastos primários cultivados a partir de alíquotas congeladas que foram submetida à temperatura desfavoráveis durante o armazenamento ou transferência continha um pequeno número de células que permaneceram viáveis 7. Estas raras células foram capazes de se expandir e podem ser passadas várias vezes. Tal observação sugeriu que uma pequena quantidade de células com elevada potência a proliferação e a resistência ao stress Encontravam-se presentes em culturas de fibroblastos humanos 7.Aproveitamos estes resultados para estabelecer um protocolo para o rápido isolamento de células-tronco adultas a partir de culturas de fibroblastos primários que estão prontamente disponíveis a partir de bancos de tecidos ao redor do mundo (Figura 1). Este método tem um significado importante, uma vez que permite o isolamento de células precursoras da pele quando as amostras não estão acessíveis ao culturas de fibroblastos podem estar disponíveis a partir de bancos de tecidos, deste modo, abrindo novas possibilidades para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes a doenças genéticas raras, bem como doenças de modelação numa prato.
Usando o método aqui descrito, células estaminais dérmicos virgens podem ser isolados a partir de culturas de fibroblastos dérmicos primários. Usando essa abordagem, que informou recentemente o isolamento e caracterização de células-tronco adultas a partir de culturas de fibroblastos derivados de pacientes com uma síndrome genética rara, Hutchinson-Gilford Progeria Síndrome 7. Como mostrar aqui as precursoras células expressam marcadores de células-tronco são capazes de auto-renovação e pode s…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alexander von Humboldt (5090371), a Kühne Centro de Christine de Alergia Pesquisa e Educação (CK-CARE), eo Bayerischen Staatsministerium (para KD).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
Methanol | Roth | 8388.2 | |
Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
Table 2. Specific reagents and equipment. |