Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов
Summary
Мы сообщаем о способе выделения наивным мультипотентны, полученных из кожи предшественника (SKP) клеток из первичной культуры фибробластов человека. Покажем, что эти SKPs, полученных из культур фибробластов имеют сходные свойства стволовых клеток, чтобы те, выводится непосредственно из биопсии человеческой кожи. Эти клетки экспрессируют нервной маркер гребень, нестин, в дополнение к мультипотентных маркеры, такие как OCT4 и Nanog.
Abstract
За последнее десятилетие в ряде популяций взрослые стволовые клетки были идентифицированы в коже человека 1-4. Выделение кожного мультипотентны взрослых прекурсоров был впервые сообщил Миллер F. D лаборатории 5, 6. Эти ранние исследования, описанные мультипотентны популяции клеток предшественников от взрослых млекопитающих дермы 5. Эти клетки – называют SKPs, для кожи полученных предшественников – были выделены и расширена от грызунов и человека кожи и дифференцировались в обоих нервных и мезодермального потомство, в том числе типов клеток не найден в коже, такие как нейроны 5. Иммуноцитохимическая исследованиях на культуре SKPs показали, что клетки экспрессируют нестин и виментин, промежуточный белок нити выражены в нервной и предшественников скелетных мышц, в дополнение к фибронектин и мультипотентных стволовых клеток маркеры 6. До сих пор взрослые стволовые клетки SKPs населения не были выделены из свежесобранных млекопитающих биопсии кожи.
ve_content "> В последнее время мы создали и сообщил, что население шкуру, полученную клетки-предшественники могли остаться присутствует в первичных культурах фибробластов устанавливается с биопсии кожи 7. предположение, что несколько стволовых соматические клетки могут находиться в первичных культурах фибробластов на ранних удвоения населения был основанных на следующие замечания: (1) SKPs и первичных культурах фибробластов являются производными от дермы, и, следовательно, небольшое количество клеток SKP могли остаться присутствует в первичных культурах фибробластов кожных и (2) первичных культурах фибробластов, выращенных из замороженного аликвоты, которые были подвергается неблагоприятным температура во время хранения или передачи содержал небольшое количество клеток, которые остаются жизнеспособными 7. Эти редкие клетки смогли расширить и может быть пассировать несколько раз. Это наблюдение предположить, что небольшое число клеток с высокой активностью пролиферации и устойчивость к стрессу присутствовали в человеческих культурах фибробластов 7.Мы воспользовались этими выводами установить протокол для быстрого выделения взрослых стволовых клеток из первичных культурах фибробластов, которые легко доступны из ткани банков по всему миру (рис. 1). Этот метод имеет важное значение, поскольку она позволяет изолировать клетки-предшественники, когда образцы кожи не доступны в то время культур фибробластов могут быть получены от банков тканей, тем самым, открывая новые возможности для того чтобы рассечь молекулярные механизмы, лежащие в основе редких генетических заболеваний, а также заболеваний в моделировании блюдо.
Protocol
Representative Results
Discussion
С помощью способа, описанного здесь, наивных кожные стволовые клетки могут быть выделены из первичных культур кожных фибробластов. Используя этот подход, мы недавно сообщали выделение и характеристика взрослых стволовых клеток из культуры фибробластов, взятых от пациентов с редким г?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа выполнена при поддержке Фонда Александра фон Гумбольдта (5090371), Кристин Кюне Центра исследований аллергии и образования (CK-CARE) и Баварской Staatsministerium (в КД).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
Referências
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, l. K. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
