Naïve Volwassen stamcellen Isolatie van primaire humane fibroblastkweken
Summary
Wij rapporteren een methode om naïeve multipotente huid-afgeleide precursor (SKP) cellen uit primaire menselijke fibroblast culturen te isoleren. We laten zien dat deze SKPs afgeleid van fibroblastculturen delen dezelfde stamcel eigenschappen aan deze die direct afgeleid van de menselijke huid biopten. Deze cellen brengen de neurale marker, nestin naast multipotente merkers zoals OCT4 en Nanog.
Abstract
In de afgelopen tien jaar hebben een aantal volwassen stamcellen populaties geïdentificeerd in de menselijke huid 1-4. De isolatie van multipotente adulte dermal voorlopers werd eerst gemeld door Miller F. D laboratorium 5, 6. Deze vroege studies beschreven een multipotent precursor cel populatie van volwassen zoogdieren dermis 5. Deze cellen – genoemd SKPs, voor huid-afgeleide precursoren – werden geïsoleerd en uitgebreid van knaagdier-en menselijke huid en gedifferentieerd in zowel neurale en mesodermale nakomelingen, waaronder celtypes nooit gevonden in de huid, zoals neuronen 5. Immunocytochemische studies op gekweekte SKPs gebleken dat cellen brachten vimentine en nestine, een intermediaire filament-eiwit expressie in neurale en skeletspieren voorlopers, naast fibronectine en multipotente stamcel markers 6. Tot nu toe hebben de volwassen stamcellen bevolking SKPs geïsoleerd uit vers verzameld zoogdierhuid biopsieën.
ve_content "> Onlangs hebben wij vastgesteld en gemeld dat een populatie van huid afgeleide voorlopercellen aanwezig in primaire fibroblastculturen opgericht uit huidbiopsieën 7 kon blijven. De veronderstelling dat een paar somatische stamcellen in primaire fibroblastculturen zou wonen op de vroege populatieverdubbelingen was gebaseerd op de volgende waarnemingen: (1) SKPs en primaire fibroblasten afgeleid van de dermis, en dus een klein aantal SKP cellen kunnen aanwezig zijn in primaire dermale fibroblasten blijft en (2) primaire fibroblasten gekweekt uit bevroren monsters die zijn onderworpen aan ongunstige bij opslag of overdracht van een klein aantal cellen die levensvatbaar 7 beperkt gebleven. Deze zeldzame cellen kan uitzetten en kan worden gepasseerd meermaals. Deze waarneming suggereerde dat een klein aantal cellen met een hoge potentie en proliferatie stressbestendigheid aanwezig in humane fibroblasten 7.We hebben gebruik gemaakt van deze bevindingen voor een protocol voor snelle isolatie van volwassen stamcellen uit primaire fibroblastculturen die gemakkelijk beschikbaar zijn uit weefsel banken wereldwijd (figuur 1) vast te stellen. Deze methode heeft een belangrijke betekenis als het kan de isolatie van voorlopercellen wanneer de huid monsters zijn niet toegankelijk wanneer fibroblastculturen verkrijgbaar kunnen zijn weefselbanken, dus nieuwe mogelijkheden openen om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen zeldzame genetische ziekten, alsook modelleren ziekten ontleden in een gerecht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de hierin beschreven werkwijze, kunnen naïeve dermale stamcellen geïsoleerd uit primaire dermale fibroblasten. Met deze benadering hebben we onlangs gemeld de isolatie en karakterisatie van volwassen stamcellen uit fibroblasten afkomstig van patiënten met een zeldzame genetische syndroom, Hutchinson-Gilford progeria syndroom 7. Zoals hierin tonen die voorlopercellen uitdrukkelijke stamcel markers zijn in staat van zelf-vernieuwing en kan worden gericht om te differentiëren in verschillende cellulaire …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Alexander von Humboldt Stichting (5090371), de Christine Kühne Centrum voor Allergie Onderzoek en Onderwijs (CK-CARE), en de Bayerischen Staatsministerium (KD).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
Referências
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, l. K. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
