Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani
Summary
Riportiamo un metodo per isolare precursori pelle-derivato multipotenti (SKP) cellule naïve da colture primarie di fibroblasti umani. Abbiamo dimostrato che queste SKPs derivati da colture di fibroblasti Share proprietà delle cellule staminali a quelle derivate direttamente da biopsie cutanee umane. Queste cellule esprimono il marcatore cresta neurale, nestin, oltre ai marcatori multipotenti quali OCT4 e Nanog.
Abstract
Nell'ultimo decennio, diverse popolazioni di cellule staminali adulte sono state identificate in pelle umana 1-4. L'isolamento di precursori multipotenti dermici adulti è stata riportata da F. Miller laboratorio D 5, 6. Questi primi studi hanno descritto una popolazione di cellule precursori multipotenti da adulto derma mammiferi 5. Queste cellule – SKPs denominati, per i precursori della pelle derivate – sono state isolate ed espanse da roditore e la pelle umana e differenziate in progenie sia neurale e mesoderma, compresi i tipi di cellule mai trovati in pelle, come i neuroni 5. Studi immunocitochimiche su SKPs coltura rivelato che le cellule esprimono vimentina e nestina, una proteina filamenti intermedi espressa in precursori neuronali e muscolari scheletriche, oltre a fibronectina e marcatori di cellule staminali multipotenti 6. Fino ad ora, le cellule staminali adulte SKPs di popolazione sono stati isolati da appena raccolti biopsie cutanee dei mammiferi.
ve_content "> Recentemente, abbiamo stabilito e riportato che una popolazione di cellule precursori della pelle derivate potrebbe rimanere presente nelle colture di fibroblasti primari stabiliti da biopsie cutanee 7. L'ipotesi che alcune cellule staminali somatiche potrebbero risiedere in colture di fibroblasti primari a raddoppi di popolazione iniziali era compatibili con i seguenti osservazioni: (1) SKPs e colture di fibroblasti primari sono derivate dal derma, e quindi un piccolo numero di cellule SKP potrebbero rimanere presente nelle colture di fibroblasti dermici primari e (2) colture primarie di fibroblasti coltivati da aliquote congelate che sono state sottoposti a temperatura sfavorevole durante la conservazione o il trasferimento conteneva un piccolo numero di cellule vitali che rimanevano 7. Queste cellule rare sono stati in grado di espandere e potrebbero essere diversi passaggi più volte. Questa osservazione suggerisce che un piccolo numero di cellule con elevata potenza proliferazione e resistenza alle sollecitazioni erano presenti in colture di fibroblasti umani 7.Abbiamo approfittato di questi risultati per stabilire un protocollo per il rapido isolamento di cellule staminali adulte provenienti da colture di fibroblasti primari che sono prontamente disponibili presso le banche dei tessuti di tutto il mondo (Figura 1). Questo metodo ha un significato importante in quanto consente l'isolamento di cellule precursori quando i campioni di pelle non sono accessibili mentre colture di fibroblasti possono essere disponibili da parte delle banche dei tessuti, in tal modo, aprendo nuove opportunità per analizzare i meccanismi molecolari alla base di malattie genetiche rare e le malattie di modellazione in un piatto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando il metodo qui descritto, le cellule staminali cutanee naive possono essere isolati da colture di fibroblasti dermici primari. Usando questo approccio, abbiamo recentemente riportato l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali adulte provenienti da colture di fibroblasti derivati da pazienti con una sindrome genetica rara, di Hutchinson-Gilford progeria sindrome 7. Come mostrano qui quei precursori cellule esprimono marcatori di cellule staminali sono in grado di auto-rinnova…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt (5090371), la Christine Kühne Center for Allergy Research and Education (CK-CARE), e la Bayerischen Staatsministerium (a KD).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
Referências
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