Naive voksne stamceller Isolering fra primære humane fibroblastkulturer

Summary

Vi rapporterer en metode til at isolere naive multipotente hud-afledt precursor (SKP) celler fra primære humane fibroblastkulturer. Vi viser, at disse SKPs stammer fra fibroblastkulturer deler lignende stamceller egenskaber til dem stammer direkte fra humane hudbiopsier. Disse celler udtrykker neuralkam markering, nestin, ud over de multipotente markører, såsom OCT4 og Nanog.

Abstract

I det sidste årti, har flere voksne stamceller populationer blevet identificeret i human hud ^1-4. Isoleringen af multipotente voksne dermal forstadier blev først rapporteret af Miller F. D laboratorium ^{5, 6.} Disse tidlige undersøgelser beskrev en multipotent forstadie cellepopulation fra voksne pattedyr dermis ^5.. Disse celler – betegnes SKPs, til hud-afledte forstadier – blev isoleret og udvidet fra gnavere og menneskehud og differentieret i både neurale og mesodermal afkom, herunder celletyper aldrig fundet i huden, såsom neuroner ^5.. Immuncytokemiske studier på SKPs viste, at celler udtrykte vimentin og nestin, et mellemliggende filamentprotein udtrykt i neurale og skeletmuskelceller forstadier, foruden til fibronectin og multipotente stamceller markører ^6. Indtil nu har de voksne stamceller befolkning SKPs blevet isoleret fra frisk indsamlede pattedyr hudbiopsier.

ve_content "> For nylig har vi etableret og rapporterede, at en befolkning på huden afledte prækursorceller kunne være til stede i de primære fibroblastkulturer oprettet fra hudbiopsier ^7.. Den antagelse, at et par somatiske stamceller kunne opholde sig i primære fibroblastkulturer på tidlige populationsfordoblinger var baseret på følgende iagttagelser: (1) SKPs og primære fibroblastkulturer er afledt fra dermis, og derfor et lille antal SKP celler kan forblive til stede i primære dermale fibroblastkulturer og (2) primære fibroblastkulturer vokset fra frosne alikvoter, der har været underkastes ugunstige temperatur under opbevaring eller overførsel indeholdt en lille antal celler, der forblev levedygtige ^7.. Disse sjældne celler var i stand til at udvide og kunne passeres adskillige gange. Denne iagttagelse antydede, at et lille antal celler med høj spredning potens og modstandsdygtighed over for stress var til stede i humane fibroblastkulturer ^7.

Vi tog fordel af disse fund til at etablere en protokol til hurtig isolering af voksne stamceller fra primære fibroblastkulturer, som er let tilgængelige fra vævsbanker hele verden (figur 1). Denne metode har vigtig betydning, da det giver mulighed for isolering af præcursorceller når hudprøver er ikke tilgængelige, mens fibroblastkulturer kan være tilgængelige fra vævsbanker dermed åbner nye muligheder for at dissekere de molekylære mekanismer, der ligger sjældne genetiske sygdomme samt modellering sygdomme i et skål.

Protocol

1.. SKP Isolering fra Primary fibroblastkulturer Fibroblastkulturer enten fra cellebanker eller direkte opnået fra hudbiopsier holdes i kultur i fibroblast-vækstmedium DMEM indeholdende 15% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin, 10 mg / ml penicillin og 10 mg / ml streptomycin. Humane fibroblaster GMO3349C og GMO8398A blev opnået fra Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ) og blev anvendt i denne undersøgelse. Kulturer fra populationsfordob…

Representative Results

Vi viser, at en population af celler, der selektivt udvide at generere SKP kugler under kontrolleret vækst tilstand bestående af EGF og FGF2 er til stede i primære dermale fibroblastkulturer (figur 1), som vi rapporteret for nylig 7.. Fibroblastkulturer fra PPD 15 til 25, der typisk svarer til de primære fibroblaster stammer tilgængelige fra cellebanker blev anvendt i denne undersøgelse. Fibroblastkulturer forelagt den dobbelte behandling bestående af kulde…

Discussion

Ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet heri, kan naive dermale stamceller isoleres fra primære dermale fibroblastkulturer. Med denne fremgangsmåde, vi for nylig rapporteret isolering og karakterisering af voksne stamceller fra fibroblastkulturer afledt fra patienter med en sjælden genetisk syndrom, Hutchinson-Gilford progeria syndrom ^7.. Som viser heri de prækursorceller udtrykkelige stamceller markører er i stand til selv-fornyelse og kan rettes til at differentiere til forskellige cellulære slæg…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.