Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Summary

Wir berichten über eine Methode, um naive multipotent Haut stammenden Vorläufer (SKP) Zellen aus primären humanen Fibroblasten Kulturen zu isolieren. Wir zeigen, dass diese SKPs von Fibroblastenkulturen abgeleitet ähnliche Stammzellen Eigenschaften teilen, die, die direkt aus der menschlichen Haut Biopsien abgeleitet. Diese Zellen exprimieren die Neuralleisten Marker Nestin, zusätzlich zu der multipotenten Marker wie OCT4 und Nanog.

Abstract

Im Laufe des letzten Jahrzehnts haben mehrere erwachsenen Stammzell-Populationen in der menschlichen Haut ^1-4 identifiziert worden. Die Isolierung von multipotent erwachsenen Haut Vorstufen wurde zuerst von F. Miller D Labor ^{5, 6} gemeldet. Diese frühen Studien beschrieben eine multipotent Vorläufer-Zell-Population von adulten Dermis ^5. Diese Zellen – bezeichnet SKPs, für Haut-abgeleiteten Vorstufen – wurden isoliert und expandiert von Nagetier-und menschlichen Haut und differenziert sowohl in neuralen und mesodermalen Nachkommen, darunter Zelltypen nie in der Haut gefunden, wie Neuronen ^5. Immunzytochemische Studien an kultivierten Zellen SKPs ergab, dass Vimentin und Nestin, ein Intermediärfilament Protein in neuronalen und Skelettmuskel Vorstufen ausgedrückt ausgedrückt zusätzlich zu Fibronektin und multipotent Stammzellmarkern ^6. Bis jetzt haben die adulten Stammzellen Bevölkerung SKPs aus frisch gesammelten Säugerhaut Biopsien isoliert worden.

ve_content "> Vor kurzem haben wir festgestellt, und berichtete, dass eine Population von Haut abgeleitet Vorläuferzellen bleiben konnte in primären Fibroblasten Kulturen aus Hautbiopsien ⁷ etabliert. Die Annahme, dass ein paar somatischen Stammzellen könnten in primären Fibroblastenkulturen am frühen Populationsverdopplungen aufzuhalten war basierend auf den folgenden Beobachtungen: (1) SKPs und primären Fibroblasten Kulturen werden von der Dermis abgeleitet und damit eine kleine Anzahl von SKP Zellen bleiben konnte in primären dermalen Fibroblasten Kulturen und (2) der primären Fibroblastenkulturen aus gefrorenen Aliquots, die angebaut wurden unterzogen, um ungünstige bei Lagerung oder Übertragung enthielt eine geringe Anzahl von Zellen, lebensfähige ⁷ blieb. Diese seltenen Zellen waren in der Lage zu erweitern und können passagiert werden mehrmals. Diese Beobachtung vorgeschlagen, dass eine kleine Anzahl von Zellen mit hoher Verbreitung Wirksamkeit und Widerstandsfähigkeit gegen Stress waren im menschlichen Fibroblastenkulturen ^7.

Wir nutzten diese Erkenntnisse, um ein Protokoll für die schnelle Isolierung von adulten Stammzellen aus primären Fibroblasten Kulturen, die leicht zugänglich von Gewebe Banken auf der ganzen Welt (Abbildung 1) zu etablieren. Diese Methode hat wichtige Bedeutung, da sie die Isolierung von Vorläuferzellen ermöglicht, wenn Hautproben nicht zugänglich sind, während Fibroblastenkulturen kann aus Gewebe Banken zur Verfügung, damit die Eröffnung neuer Möglichkeiten, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen seltene genetische Erkrankungen sowie Erkrankungen Modellierung in eine sezieren Gericht.

Protocol

1. SKP Isolation von Primär Fibroblastenkulturen Fibroblasten-Kulturen entweder aus Zellbanken oder direkt aus Hautproben sind in Kultur in Fibroblastenwachstumsfaktor DMEM mit 15% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 10 mg / ml Penicillin und 10 mg / ml Streptomycin gehalten. Humane Fibroblasten GMO3349C und GMO8398A wurden aus dem Coriell Institut für medizinische Forschung (Camden, NJ) erhalten und wurden in dieser Studie verwendet. Kulturen von …

Representative Results

Wir zeigen, dass eine Population von Zellen, die selektiv zu erweitern, um SKP Sphären unter kontrollierten Wachstumsbedingungen bestehend aus EGF und FGF2 erzeugen in primären dermalen Fibroblasten-Kulturen (Abb. 1) sind, wie wir vor kurzem 7 gemeldet. Fibroblasten-Kulturen aus PPD 15 bis 25, die üblicherweise für den Fibroblasten-Stämme erhältlich Zellbanken entsprechen, wurden in dieser Studie verwendet. Fibroblasten-Kulturen hat dem Doppel-Behandlung, be…

Discussion

Unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens können naiven dermale Stammzellen aus primären dermalen Fibroblasten Kulturen isoliert werden. Mit diesem Ansatz haben wir vor kurzem berichtet, die Isolierung und Charakterisierung von adulten Stammzellen aus Fibroblastenkulturen von Patienten mit einer seltenen genetischen Syndrom, Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom ⁷ abgeleitet. Wie hier zeigen diese Vorläuferzellen express Stammzell-Marker sind in der Lage sich selbst zu erneuern und gerichtet in ve…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.